Una rápida y cuantitativa método fluorimétrico para la proteína-Targeting Pequeña Molécula De Drogas
Summary
A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.
Abstract
Se demuestra un nuevo método de detección de drogas para determinar la afinidad de unión de pequeñas moléculas de fármacos a una proteína diana mediante la formación de nanoclusters fluorescentes oro (Au CN) dentro de la proteína cargada con fármaco, basados en la señal diferencial de fluorescencia emitida por el Au NCs. Proteínas tales como albúmina de suero de albúmina humana (HSA) y albúmina de suero bovino (BSA) se seleccionan como las proteínas modelo. Cuatro pequeños fármacos moleculares (por ejemplo, ibuprofeno, warfarina, fenitoína y sulfanilamida) de diferentes afinidades de unión a las proteínas de albúmina se ponen a prueba. Se encontró que la tasa de formación de Au NCs fluorescentes dentro de la proteína albúmina cargadas de fármaco en condiciones desnaturalizantes (es decir, 60 ° C o en presencia de urea) es más lento que el formado en la proteína prístina (sin drogas). Por otra parte, la intensidad fluorescente de la CN como formado se encontró que se correlaciona inversamente con las afinidades de unión de estos fármacos a las proteínas de albúmina. Particularmente,cuanto mayor es la afinidad de unión a proteína de drogas, más lenta será la velocidad de formación de Au CN, y por lo tanto se observa una intensidad de fluorescencia inferior de la resultante Au NCs. La intensidad de fluorescencia de la resultante Au NCs por lo tanto, proporciona una medida sencilla de la fuerza de unión relativa de los diferentes fármacos ensayados. Este método también es extensible para medir la constante de unión específica de proteína-fármaco (K D) simplemente variando el contenido de fármaco precargado en la proteína a una concentración de proteína fija. Los resultados medidos coinciden bien con los valores obtenidos utilizando otros métodos de prestigio pero más complicados.
Introduction
Albúminas séricas tales como albúmina de suero humano (HSA) y albúmina de suero bovino (BSA) son la proteína más abundante en el plasma y juegan un papel vital en el mantenimiento de la presión osmótica del compartimiento de sangre. También son reconocidos como proteínas portadoras para las pequeñas moléculas de baja solubilidad en agua, tales como esteroides, ácidos grasos, hormonas tiroideas, y una amplia variedad de fármacos. La propiedad de unión (por ejemplo, sitios de unión, afinidad o fuerza de unión) de estas moléculas a suero albúminas forma un tema importante en la farmacocinética. 1-4 Varios métodos analíticos se han desarrollado para estudiar las propiedades de unión de diferentes fármacos al suero albúminas, tales como cristalografía de rayos X, 5,6 resonancia magnética nuclear (RMN), 7-11 y resonancia de plasmón superficial (SPR), 12,13 etc. Sin embargo, estos métodos están limitados ya sea por un proceso de análisis tedioso y requiere mucho tiempo (por ejemplo, el crecimiento del cristal único para Crystallo de rayos Xestudio gráfico), requerimiento de equipo especializado y caro (SPR), o en necesidad de etiquetado de isótopos costosa (RMN) para la detección. Por tanto, es altamente deseable desarrollar métodos alternativos para la detección de drogas molecular pequeña de una manera rápida y directa, y rentable.
Nanoclusters oro (Au CN) son un tipo especial de nanomaterial, que contienen varias decenas de átomos de metal con tamaños menores de 2 nm. 14-17 Ellos han atraído amplios intereses de investigación debido a su estructura electrónica discreta y dependiente del tamaño, 18, 19 y molecular como absorciones y emisiones. 20-23 Tales propiedades materiales únicos, en particular, la fuerte fluorescencia, han encontrado diversas aplicaciones tales como detección y proyección de imagen en los sistemas biológicos. ultrapequeño de 24-32 fluorescente Au NCs se puede sintetizar utilizando proteínas funcionales, tales como albúminas séricas, como plantilla. 33 En un típico síntesis de proteínas con plantilla de Au NCs, una cierta cantidad de sales de Au están encapsulados dentro de la primera proteína y posteriormente reducida por la propia proteína. La capacidad reductora de la proteína se atribuye a Constituyente residuos de aminoácidos funcionales (por ejemplo, tirosina) que se pueden activar mediante el aumento del pH de la solución a alcalino. Despliegue de la estructura de la proteína se considera como un paso fundamental para la formación de Au CN. Esto es porque en una proteína desplegada, los grupos funcionales más reductores pueden estar expuestos a las sales de Au encapsulados. Desplegamiento de la proteína se puede lograr mediante tratamiento térmico o la exposición a agentes desnaturalizantes. La introducción de pequeños drogas moleculares también puede afectar el proceso de desarrollo, es decir, la modificación de la temperatura de desnaturalización punto medio y la entalpía de despliegue. 34,35 El efecto de todos estos factores, a su vez, puede ser reflejada por la cinética de formación de fluorescente Au CN y se manifiesta en la intensidad de fluorescencia de las resultantes Au CN. 36
e_content "> Este video demuestra el método de cribado de fármacos mediante la síntesis de Au NCs en las proteínas de albúmina cargadas con fármaco a una temperatura más alta (60 ° C) o en presencia de agentes desnaturalizantes (por ejemplo, urea). La intensidad de fluorescencia de resultante Au NCs es la lectura de la señal. En primer lugar, Au NCs se sintetizan en HSA y BSA plantillas tratadas a 60 ° C o en presencia de urea para mostrar cómo desplegamiento de la proteína (inducida por tratamiento térmico o desnaturalizantes) afecta a la cinética de formación de Au NCs. En segundo lugar, Au NCs se sintetizan en las plantillas de proteínas precargado con diferentes fármacos, y el efecto de carga de fármaco en las intensidades de fluorescencia relativas de resultante Au NCs se estudia, que proporcionan la medida de la fuerza de unión relativa. Finalmente, el protocolo de cribado Au NC-fármaco se modifica para medición cuantitativa de la proteína-fármaco constante de unión (K D) mediante la variación del contenido de fármaco precargado en la proteína de una concentración fija.Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varios pasos críticos que deben ser destacados en este método. En el protocolo de la detección de la afinidad de unión relativa de los diferentes fármacos moleculares pequeños, Etapas 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 y son críticos para obtener buenos resultados que muestran tendencia constante para la fuerza de unión relativa. En estos pasos, las acciones de adición de productos químicos y el dibujo soluciones de reacción para la medición deben ser lo más rápidamente posible para minimizar el efecto tiempo de reta…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.
Materials
| Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
| Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| 384-well plate | Corning | ||
| 5 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 1000 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 100 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 5000 mL Eppendorf tips | |||
| 1000 mL Eppendorf tips | |||
| 100 mL Eppendorf tips | |||
| 1.5 mL micro tube | Eppendorf | ||
| 20 mL glass vial with screw cap | |||
| 4 mL glass vial with screw cap |
References
- Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
- Vuignier, K., Veuthey, J. -. L., Carrupt, P. -. A., Schappler, J. Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis. Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).
- Zsila, F. Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model. Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).
- Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability. J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).
- Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. . Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).
- Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin. J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).
- Dalvit, C., et al. High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments. J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).
- Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study. Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).
- Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).
- Salvi, N., et al. Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States. J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).
- Zsila, F. Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin. J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).
- Navratilova, I., Hopkins, A. L. Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance. ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).
- Wang, Y., et al. Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability. Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).
- Lu, Y., Chen, W. Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries. Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).
- Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters. Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).
- Jin, R. Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters. Nanoscal. 2, 343-362 (2010).
- Jiang, D. -. e. The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond. Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).
- Aikens, C. M. Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters. J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).
- Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS. ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).
- Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).
- Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties. J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).
- Yu, Y., et al. Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster. J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).
- Jiang, J., et al. Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).
- Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters. Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).
- Niesen, B., Rand, B. P. Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices. Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).
- Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications. Nano Toda. 6, 401-418 (2011).
- Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo. Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).
- Archana, R., et al. Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging. Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).
- Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions. Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).
- Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water. 20, 951-1907 (2010).
- Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance. J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).
- Negishi, Y., et al. Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity. J. Phys. Chem. C. , (2015).
- Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters. J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).
- Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility. Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes. Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).
- Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening. Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).
- Shortridge, M. D. . Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. , (2010).
