שימוש<em> Ex Vivo</em> תרבויות הזקופה טיפה של איברים העובר שלמים לחקר תהליכים התפתחותיים בעכבר organogenesis
Summary
The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.
Abstract
חוקר organogenesis ברחם הוא תהליך מאתגר מבחינה טכנית ביונקי שליה בשל חוסר נגישות של חומרים כימיים לעוברים המתפתחים בתוך הרחם. שיטה חדשה שפותחה תרבות אגל vivo לשעבר זקופה מספקת חלופה אטרקטיבית למחקרים שבוצעו ברחם. תרבות אגל vivo לשעבר מספקת את היכולת לבחון ולטפל אינטראקציות הסלולר ומסלולי איתות מגוונים באמצעות שימוש בחסימה שונות ותרכובות הפעלה; בנוסף, את ההשפעות של חומרים כימיים תרופתיים שונים על התפתחות איברים ספציפיים ניתן ללמוד ללא תופעות לוואי בלתי רצויות של אספקת סמים מערכתית ברחם. בהשוואה לאחרים במערכות חוץ גופית, תרבות אגל לא רק מאפשרת ליכולת ללמוד אינטראקציות תלת-ממדי המורפוגנזה ותאי תאים, שלא יכול להיות מועתקות בשורות תאי יונקים, אלא גם דורשת פחות משמעותי reagents מאשר אחר vivo לשעבר ובפרוטוקולי מבחנה. מסמך זה מדגים נתיחה נכונה עכבר עוברית איבר וטכניקות תרבות טיפה זקופות, ואחריו immunofluorescence איבר השלם כדי להדגים את היעילות של השיטה. Vivo לשעבר שיטת תרבות אגל מאפשרת ההיווצרות של אדריכלות איבר דומה למה שרואה בvivo ויכול להיות מנוצל כדי ללמוד תהליכים קשים למחקר אחר בשל קטלני עוברית במודלי in vivo. כמערכת יישום מודל, מעכב מולקולה קטנה ישמש לחקור את התפקיד של כלי דם בהמורפוגנזה אשכים. vivo לשעבר שיטת תרבות אגל זה ניתנת להרחבה למערכות אחרות של העובר איברים, כגון ריאות ואפשרות אחרות, אם כי כל איבר חייב להיות בהרחבה למד לקבוע שינויים איבר ספציפי לפרוטוקול. מערכת תרבות איבר זה מספקת גמישות בניסויים עם איברי העובר, ותוצאות obtaineד באמצעות טכניקה זו תסייע לחוקרים להרוויח תובנות בהתפתחות עוברים.
Introduction
התחדשות איברים in vivo בבני האדם היא מוגבלת מאוד; לכן, הנדסת רקמות, התפתחות רקמות ואיברים מהתאים בודדים שנתרמו על ידי מארח, הופכת טיפול פוטנציאלי אטרקטיבי להחלפת איברים. עם זאת, לאסטרטגיה טיפולית זו כדי להצליח, גורמים ואינטראקציות הסלולר מעורבות בהמורפוגנזה של האיבר יש ללמוד ביסודיות והבינו היטב. בשל חוסר היכולת ללמוד פיתוח של איברים ספציפיים עם גישות מסורתיות, חוקרים פנו לעובר כל חלופה או תרבויות איבר שלמות. Kalaskar et al. 1 הראה כי תרבות עובר כל vivo לשעבר מניבה תוצאות דומות (58% בעוברים בתרבית) בפיתוח הרחם, המצביע על כך שיטות תרבות vivo לשעבר הן אלטרנטיבה אפשרית ללימודי organogenesis.
מערכת אישית איבר תרבות, כגון זה vivo לשעבר droplet מערכת התרבות, מאפשרת לעצמאית ניתוח איבר שלם של השפעות מערכתיות, תוך התרת מניפולציה של מסלול איתות ספציפי או אינטראקציות הסלולר באמצעות תוספת של חומרים כימיים או נוגדנים תרופתיים. באופן מסורתי, המחקר של פיתוח איבר העוברי היה מוגבל לטכנולוגיות מהונדסים ועכבר נוקאאוט, בנוסף לחומרים כימיים תרופתיים נמסרו אימהי. עם זאת, יש בעיות טכניות הכרוכות בטכניקות אלה וטיפולים בvivo; רוב החששות סובבים סביב תופעות של השפעה על איברים שונים בו זמנית אשר לעתים קרובות תוצאות קטלניות עוברי. חשש נוסף של מחקרי מניפולציה התפתחות עוברים פרמקולוגית הוא ההשפעה האימהית של תרופות על התפתחות עוברית ברחם (למשל, חילוף חומרים אימהיים של התרופה לפני שהוא מגיע לעובר) ואם ריאגנטים כזה יכול לעבור את מחסום השליה.
טכניקת תרבות איבר השלמה תיארהכאן הותאם מפרוטוקול שתואר לראשונה על ידי Maatouk et al. 2, שבו בלוטות מין העובר כל מודגרת בתרבויות טיפה זקופות vivo לשעבר. יתרון משמעותי אחד culturing בלוטות מין העובר הוא שמעכבי מולקולה קטנה יכולים בקלות לגשת לכל האיבר בדיפוזיה פשוטה. . DeFalco et al הראה כי ניצול vivo לשעבר שיטת תרבות אגל זה בשיתוף עם מעכבי מולקולה קטנה יכול לשמש כדי לחקור תהליכי איתות ואינטראקציות המתרחשות במהלך התפתחות בלוטת מין 3; תהליכים אלה יהיו קשים לבחון in vivo בשל אתגרים טכניים (למשל, מעבר של תרופות דרך השליה או הקטלני של איברים המשפיעים מרובים באמצעות גישות גנטיות או תרופתיות).
תרבות רביב היא לא רק שיפור בהיבטים מסוימים על בניסויים ברחם, אבל גם את זה הוא שיפור לעומת במבחנה ולשעבר viמערכות VO גם כן. השימוש בשורות תאים ללמוד המורפוגנזה קשה מאוד כי חסרים להם הסוגים השונים של תאים, חסרי רכיבים קריטיים מטריצה תאית (ECM) המאפשרים את היווצרותה של אדריכלות איבר, ויכול להציג חפצים באיתות מפלים. למרות הנדסת רקמות עשתה שיפורים משמעותיים ביצירת פיגומי הדמית ECM, חוסר הידע לגביהם אותות נדרשים על ידי כל סוג תא בorganogenesis עושה את זה מאתגר לבנות מערכת איברים במבחנה. מערכות אחרות vivo לשעבר כבר הוקמו בעבר ללמוד organogenesis, או לייתר דיוק המורפוגנזה, והיו מוצלח מאוד עבור הדמיה חיה של איברי העובר באגרו 4, 5 Transwells, מסננים 6, ומטריצות פיגום אחרות 7,8. היתרון של מערכת תרבות הטיפה הוא שהיא מאפשרת המחקר של המורפוגנזה על ידי מתן האפשרות לניצול פחות חומרים כימיים, אשר often יקר, אלא גם נותן את מתח פן איבר, וזה חשוב ליכולות צמיחה ואיתות 9.
בעכבר, המורפוגנזה אשך ראשונית מתרחשת בין העוברית (E) בשלבי E11.5 וE13.5; שלבים אלה מהווים את חלון הזמן האופטימלי לבחינת גורמים המשפיעים על התמיינות מין ספציפי. בין התהליכים הקריטיים המתרחשים במהלך היווצרות אשך הדור של אדריכלות כבל אשך ויצירת רשת כלי דם אשך ספציפי הם. ניצול לשעבר מערכת תרבות אגל זה vivo כל איבר, אחד הוא מסוגל לשנות כלי דם זכר ספציפי ומעכבים המורפוגנזה אשך באמצעות מעכבי מולקולה קטנה שחוסם את הפעילות של הקולטנים לגורם גדילה של אנדותל כלי דם (VEGF); שיפוץ של כלי דם בתיווך VEGF הוא קריטי להתפתחות אשכים 10-12. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת בהצלחה לאיברים אחרים ויכולה למקד את הזמן ספציפיחלונות של פיתוח. כל הר ההדמיה האיבר מאפשרת ההדמיה של מבנים חיוניים, כמו גם שינויים מבניים וסלולריים כתוצאה מהממשל של מעכבים שונים. חשוב לציין, מערכת זו יש יתרון בכך שהחוקר יכול לעקוף תופעות בלבול פוטנציאליות מממשל תרופה אימהי או שיבוש מערכתי בin vivo אסטרטגיות גן ממוקד. כך, מערכת כולה תרבות אגל vivo לשעבר איבר זה יכול לשפר באופן משמעותי את היכולת להבין את יחסי הגומלין והאיתות שמתרחשים במיוחד באיברים מסוימים במהלך התפתחות עוברית.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר זה מדגים שיטת vivo לשעבר איבר שלמה טיפה שיש יישומים פוטנציאליים רבים ללימוד התפתחות העובר. טכניקה זו יכולה לשמש לאיברים מרובים, ומאפשרת לחוקר לענות על שאלות ביולוגיות שקשה לבחון באמצעות in vivo גישות בשל חוסר נגישות של עוברים וקטלניים עובריים פוטנציאל. יש ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O’Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.
Materials
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible | Sally Hansen | N/A | |
| 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes & Detached Flat Caps | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2170 | |
| Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2176 | |
| 10 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1096FR | |
| 20 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1121 | |
| 200 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1122 | |
| 1000 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
| 1 ml syringe with 27gauge needles | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| 10 ml syringe | BD | 305559 | |
| 0.2 μM PES syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35mm Easy Grip Style Cell Culture Dish | Falcon/Corning | 353801 | |
| Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Biosafety Cabinet | Nuare | NU-425-400 | |
| Mini-centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 stereomicroscope | Nikon | SMZ445 | |
| MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software | Alpha Innotech Corporation | Discontinued | |
| Absolute 200 proof Ethanol | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| XY PCR Primer | IDT | N/A | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-500 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| 1% Ethidium bromide solution | Fisher | BP1302-10 | Toxic |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Solutions | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | Toxic |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Hydrogen Chloride (HCl) | Fisher | A144212 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100-nm filtered | Fisher | 03-600-511 | Heat-inactivate before using |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Use at 1:100 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II – CAS 269390-69-4 – Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Rabbit Anti-Sox9 Antibody | Millipore | AB5535 | Use at dilution: 1:4,000 |
| Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody | BD Pharmingen | 553370 | Use at dilution: 1:250 |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signaling | 9661S | Use at dilution: 1:250 |
| Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Use at dilution: 1:500 |
| Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen (Molecular Probes) | H1399 | Use at 2ug/ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A31572 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21206 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21208 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Life Technologies | A31573 | Use at dilution: 1:500 |
References
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803 (2014).
- Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).
- DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).
- Walton, K. D., Kolterud, A. Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development. J. Vis. Exp. (91), e51817 (2014).
- Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An ex vivo culture system to study thyroid development. J. Vis. Exp. (88), e51641 (2014).
- Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. (66), e3979 (2012).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
- Combes, A. N., et al. et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation. Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).
- Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).
- Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).
- Clapcote, S. J., Roder, J. C. Simplex PCR assay for sex determination in mice. BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).
- Nel-Themaat, L., et al. et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in. Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).
- Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination. Development. 122, 2813-2822 (1996).
- Morais da Silva, S., et al. et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds. 14, 62-68 (1996).
- Rockich, B. E., et al. Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).
- Brennan, J., Capel, B. One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).
- Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. Male-specific cell migration into the developing gonad. Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).
- Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis using an organ culture technique. Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471, 504-507 (2011).
- Gohbara, A., et al. In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system. Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).
