Gebruik<em> Ex Vivo</em> Upright Droplet Culturen van Whole Foetale organen Developmental processen te bestuderen tijdens Mouse Organogenese
Summary
The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.
Abstract
Onderzoeken van de organogenese in de baarmoeder is een technisch uitdagend proces in zoogdieren als gevolg van ontoegankelijkheid van reagentia om embryo's die zich ontwikkelen in de baarmoeder. Een nieuw ontwikkelde ex vivo opstaande druppeltje kweekmethode biedt een aantrekkelijk alternatief voor studies uitgevoerd in utero. De ex vivo druppel cultuur biedt de mogelijkheid te onderzoeken en te manipuleren cellulaire interacties en diverse signaalwegen door het gebruik van verschillende blokkerende en activerende verbindingen; Bovendien kunnen de effecten van verschillende farmacologische reagentia voor de ontwikkeling van specifieke organen worden onderzocht zonder de bijwerkingen van systemische geneesmiddelafgifte in utero. In vergelijking met andere in vitro systemen, de druppel cultuur laat niet alleen het vermogen om driedimensionale morfogenese en cel-cel interacties te bestuderen, die niet kan worden gereproduceerd in zoogdiercellijnen, maar vereist aanzienlijk minder reagents dan andere ex vivo en in vitro protocollen. Dit document toont goede muis foetaal orgaan dissectie en opstaande druppeltje kweektechnieken, gevolgd door immunofluorescentie gehele orgaan om de effectiviteit van de werkwijze te demonstreren. De ex vivo druppel kweekmethode maakt de vorming van orgaanarchrtectuur vergelijkbaar met wat wordt waargenomen de vivo en kan worden gebruikt om op andere wijze moeilijk te bestuderen processen als gevolg van embryonale letaliteit bij in vivo modellen te bestuderen. Als modelapplicatie systeem, zal een kleine-molecule inhibitor worden gebruikt om de rol van vascularisatie in testiculaire morfogenese sonde. Dit ex vivo druppel kweekwerkwijze worden uitgebreid tot andere foetale orgaansystemen, zoals long- en mogelijk andere, hoewel elke orgaan uitgebreid moet worden bestudeerd om een orgaan-specifieke modificaties aan het protocol te bepalen. Dit orgelcultuur systeem biedt flexibiliteit in de experimenten met foetale organen, en resultaten obtained met behulp van deze techniek zal helpen onderzoekers krijgen inzicht in de ontwikkeling van de foetus.
Introduction
Orgaanregeneratie in vivo bij mensen is zeer beperkt; Daarom tissue engineering, de ontwikkeling van weefsels en organen van afzonderlijke cellen gedoneerd door een gastheercel, wordt een aantrekkelijke potentiële therapie voor orgaantransplantatie. Voor deze therapeutische strategie staat, factoren en cellulaire interacties betrokken bij morfogenese van het orgaan worden grondig bestudeerd en goed begrepen. Vanwege het onvermogen om ontwikkeling van specifieke organen traditionele benaderingen bestuderen, hebben onderzoekers zich tot alternatieve gehele embryo of geheel orgaankweken. Kalaskar et al. 1 blijkt dat ex vivo gehele embryogenese cultuur levert vergelijkbare resultaten (in 58% van de gekweekte embryo's) in utero ontwikkelen, wat suggereert dat ex vivo kweekmethoden een haalbaar alternatief voor de organogenese studies.
Een geïndividualiseerd orgaan kweeksysteem, als deze ex vivo droPlet cultuur systeem, zorgt voor een hele orgel analyse onafhankelijk van systemische effecten, terwijl het toelaten van manipulatie van een specifieke signaleringsroute of cellulaire interacties via toevoeging van farmacologische reagentia of antilichamen. Traditioneel is de studie van foetale orgaanontwikkeling beperkt tot transgene en knockout muis technologie, naast farmacologisch reagentia maternaal opgeleverd. Echter, er technische problemen met deze technieken en behandelingen in vivo; meeste betrekking draaien om de effecten beïnvloeden verschillende organen tegelijkertijd wat vaak resulteert in embryonische letaliteit. Een extra zorg van studies manipuleren foetale ontwikkeling farmacologisch is de moederlijke invloed van drugs op de embryonale ontwikkeling in de baarmoeder (bv, het metabolisme van het geneesmiddel de moeder voordat het de embryo bereikt) en indien deze reagentia kan passeren de placenta.
De hele orgelcultuur techniek beschrevenHier werd aangepast van een protocol eerst beschreven door Maatouk et al. 2, waarin gehele foetale gonaden geïncubeerd in ex vivo kweken rechtop druppel. Een belangrijk voordeel van het kweken van foetale geslachtsklieren is dat kleine moleculen remmers gemakkelijk toegang tot de hele orgel door eenvoudige diffusie. . DeFalco et al hebben aangetoond dat het gebruik van deze ex vivo druppeltje kweekmethode in combinatie met kleine moleculen remmers kunnen worden gebruikt om te bestuderen signalering processen en interacties in gonade ontwikkeling 3; deze werkwijzen moeilijk te onderzoeken in vivo is vanwege technische problemen (bijv passage van geneesmiddelen door de placenta of letaliteit beïnvloeden meerdere organen via genetische of farmacologische benaderingen).
De druppel cultuur niet alleen een verbetering van bepaalde aspecten meer in utero experimenten, maar ook een verbetering is in vitro en ex vivo systemen. Het gebruik van cellijnen morfogenese bestuderen uiterst moeilijk omdat zij niet de diverse celtypen, geen kritische extracellulaire matrix (ECM) componenten die de vorming van orgaanarchrtectuur mogelijk en kunnen artefacten vertonen bij het signaleren van cascades. Hoewel tissue engineering aanzienlijke verbeteringen heeft aangebracht in het creëren van steigers ECM simuleren, het gebrek aan kennis met betrekking tot welke signalen nodig zijn door elk type cel tijdens de organogenese maakt het een uitdaging om een orgel te bouwen in vitro. Andere ex vivo systemen zijn vooraf ingesteld om organogenese studie, of specifieker morfogenese en zijn zeer succesvol voor levende beeldvorming van foetale organen agar 4 is, transwells 5, 6 filters en andere scaffold matrices 7,8. Het voordeel van de druppel kweeksysteem is dat het de studie van morfogenese van de mogelijkheid om minder reagentia, die gebruik often duur, maar het moet ook het orgaan oppervlaktespanning, wat belangrijk is voor de groei en signalering capaciteiten 9.
In de muis, eerste testis morfogenese plaats tussen embryonale (E) stadia E11.5 en E13.5; deze fasen bestaan uit de optimale tijd-venster voor de behandeling van factoren dat seks-specifieke differentiatie beïnvloeden. Onder de kritische processen die optreden tijdens testis formatie zijn de generatie van testis koord architectuur en de vorming van een testis-specifieke vasculaire netwerk. Gebruik makend van deze ex vivo gehele orgaan druppel kweeksysteem is men in staat om mannelijk-specifieke vascularisatie veranderen en remmen testis morfogenese door middel van een klein molecuul remmer blokkeert de activiteit van de receptoren voor vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF); VEGF-gemedieerde vasculaire remodeling is van cruciaal belang voor de testis ontwikkeling 10-12. Deze techniek kan met succes worden toegepast op andere organen en kunnen specifieke tijd richtenramen van ontwikkeling. Whole-mount orgel beeldvorming maakt de visualisatie van vitale structuren en structurele en cellulaire veranderingen als gevolg van de toediening van verschillende remmers. Belangrijk is dit systeem het voordeel dat de onderzoeker mogelijke verstorende effecten van maternale toediening of systemische verstoring tijdens de in vivo doelgen strategieën kunnen omzeilen. Zo kan deze hele orgaan ex vivo druppel kweeksysteem aanzienlijke verbetering van het vermogen de interacties en signalering die specifiek optreden binnen bepaalde organen tijdens de foetale ontwikkeling te begrijpen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze studie toont een ex vivo hele orgel druppel methode die veel potentiële toepassingen voor het bestuderen van de foetale ontwikkeling heeft. Deze techniek kan worden gebruikt voor meerdere organen, en kan de onderzoeker biologische vragen die moeilijk te onderzoeken het gebruik in vivo nadert gevolg ontoegankelijkheid van embryo's en embryonale letaliteit potentiële pakken. Deze cultuur methode heeft extra voordelen boven andere in vitro benaderingen zoals zoogdiercellijnen:…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O’Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.
Materials
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible | Sally Hansen | N/A | |
| 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes & Detached Flat Caps | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2170 | |
| Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2176 | |
| 10 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1096FR | |
| 20 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1121 | |
| 200 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1122 | |
| 1000 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
| 1 ml syringe with 27gauge needles | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| 10 ml syringe | BD | 305559 | |
| 0.2 μM PES syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35mm Easy Grip Style Cell Culture Dish | Falcon/Corning | 353801 | |
| Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Biosafety Cabinet | Nuare | NU-425-400 | |
| Mini-centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 stereomicroscope | Nikon | SMZ445 | |
| MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software | Alpha Innotech Corporation | Discontinued | |
| Absolute 200 proof Ethanol | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| XY PCR Primer | IDT | N/A | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-500 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| 1% Ethidium bromide solution | Fisher | BP1302-10 | Toxic |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Solutions | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | Toxic |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Hydrogen Chloride (HCl) | Fisher | A144212 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100-nm filtered | Fisher | 03-600-511 | Heat-inactivate before using |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Use at 1:100 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II – CAS 269390-69-4 – Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Rabbit Anti-Sox9 Antibody | Millipore | AB5535 | Use at dilution: 1:4,000 |
| Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody | BD Pharmingen | 553370 | Use at dilution: 1:250 |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signaling | 9661S | Use at dilution: 1:250 |
| Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Use at dilution: 1:500 |
| Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen (Molecular Probes) | H1399 | Use at 2ug/ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A31572 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21206 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21208 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Life Technologies | A31573 | Use at dilution: 1:500 |
References
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803 (2014).
- Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).
- DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).
- Walton, K. D., Kolterud, A. Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development. J. Vis. Exp. (91), e51817 (2014).
- Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An ex vivo culture system to study thyroid development. J. Vis. Exp. (88), e51641 (2014).
- Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. (66), e3979 (2012).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
- Combes, A. N., et al. et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation. Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).
- Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).
- Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).
- Clapcote, S. J., Roder, J. C. Simplex PCR assay for sex determination in mice. BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).
- Nel-Themaat, L., et al. et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in. Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).
- Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination. Development. 122, 2813-2822 (1996).
- Morais da Silva, S., et al. et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds. 14, 62-68 (1996).
- Rockich, B. E., et al. Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).
- Brennan, J., Capel, B. One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).
- Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. Male-specific cell migration into the developing gonad. Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).
- Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis using an organ culture technique. Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471, 504-507 (2011).
- Gohbara, A., et al. In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system. Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).
