Les propriétés immunomodulatrices des cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC) apparaissent de plus en plus pertinentes pour l'application clinique. L'utilisation d'un système de co-culture de cellules souches mésenchymateuses et leucocytes du sang périphérique pré-colorées avec le succinimidyl ester de carboxyfluorescéine fluorescent du colorant (CFSE), nous décrivons l'évaluation de l'immunomodulation MSC in vitro sur la prolifération des leucocytes et effectrice des sous-populations spécifiques.
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Article de méthode
Évaluation de la propriétés immunomodulatrices des mésenchymateuses humaines cellules souches (MSC)
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les propriétés immunomodulatrices des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSM) multilignées semblent être très pertinentes pour une utilisation clinique dans un large éventail de maladies liées au système immunitaire. Les mécanismes impliqués sont de plus en plus élucidés et, dans cet article, nous décrivons l’expérience de base pour évaluer l’immunomodulation des CSM en dosant la suppression de la prolifération des leucocytes effecteurs. La prolifération des leucocytes peut être évaluée par un certain nombre de techniques, et nous décrivons dans ce protocole l’utilisation du colorant cellulaire fluorescent carboxyfluorescéine ester succinimidylique (CFSE) pour marquer les leucocytes avec des analyses ultérieures par cytométrie en flux. Cette technique permet non seulement d’évaluer la prolifération sans radioactivité, mais aussi le nombre de divisions cellulaires qui se sont produites, ainsi que d’identifier la population spécifique de cellules proliférantes et l’expression intracellulaire des cytokines/facteurs. De plus, le test peut être adapté pour évaluer des populations spécifiques de leucocytes effecteurs par sélection de marqueurs de surface de billes magnétiques de populations de cellules mononucléées de sang périphérique unique avant la co-culture avec des CSM. La flexibilité de ce test de co-culture est utile pour étudier les interactions cellulaires entre les CSM et les leucocytes.
Introduction
Les cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC) sont somatiques progéniteurs qui peuvent se différencier en lignées mésodermiques paraxiaux de l'os, le cartilage, le tissu adipeux et 4/1, ainsi que de quelques lignées extramesodermal 5. Première isolé de la moelle osseuse adulte, ces progéniteurs multilignée ont été trouvés dans de nombreux tissus 6-8 et, de façon inattendue, montré pour avoir des propriétés immunomodulatrices fortes qui apparaissent prête très bien à l'application clinique 9-12. Mécanismes détaillés impliqués dans les effets immunomodulateurs sont activement à l'étude pour une application ....
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Protocole
Le consentement éclairé du patient, tel qu'approuvé par le conseil d'examen institutionnel doit être obtenue pour l'utilisation de cellules humaines.
1. Densité isolement Gradient de cellules mononucléaires du sang périphérique humain (CMSP)
- Ajouter 25 ml du sang total hépariné dans un tube de 50 ml par 25 ml d'une pipette.
- Diluer les cellules avec 25 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Ajouter 15 ml d'un gradient de densité Ficoll-Paque dans un nouveau tube de 50 ml, et tout en inclinant le tube, très lentement et avec précaution ajouter à 25 ml de la suspension ....
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Résultats
La figure 1 représente le schéma d'ensemble de l'expérience, et la figure 2 illustre l'aspect des différentes conditions de culture cellulaire en tant que visualisées par contraste de phase inversé microscopie. MSC sont des cellules adhérentes avec un fibroblastique, la morphologie en forme de fuseau, tandis que les PBMC et les leucocytes sont de petites cellules non adhérentes rondes. Ces deux types de cellules morphologiquement différents peuvent être clairement vus dans la co-culture. À la fi.......
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Discussion
De plus en plus, les propriétés immunomodulatrices des CSM se traduisent en utilisation clinique plus rapidement que la capacité de multilignage de ces cellules souches18-20. Ainsi, les techniques de co-culture de CSM avec des leucocytes et les tests pour évaluer la fonction immunitaire sont importants pour mieux délimiter les mécanismes spécifiques impliqués dans ces propriétés afin d’optimiser l’application thérapeutique efficace.
L’un des aspects techniques les plus critiques po.......
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Déclarations de divulgation
Nous n’avons rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de l’INDH (CS-104-PP-06 à B.L.Y.).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 AG | Grandient de densité pour l’isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) |
| Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE) | Life Technologies | V12883 | Marquage cellulaire pour la détection de la division cellulaire |
| Phytoagglutinine (PHA) | Sigma | L8902 | Activation des PBMC humains |
| Dynabeads Activateur T humain CD3/28 | Life Technologies | 111.32D | Activation des lymphocytes T humains, e.g. CD4+ lymphocytes T, CD8+ lymphocytes T, etc. |
| autoMACS&trade ; Séparateur | Miltenyi Biotec | autoMACS&trade ; Séparateur | de cellules magnétique |
| autoMACS® ; Colonnes | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | colonnes de séparation |
| CD14 microbilles, humain ; | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | Pour une sélection positive des monocytes et macrophages humains CD14+ à partir de microbilles de |
| CD4 PBMC, humains ; | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | Pour une sélection positive des lymphocytes T humains CD4+ des PBMC |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875 | Milieu de culture PBMC/leucocytes humains |
| DMEM, Low glucose, pyruvate | Life Technologies | 11885 | Milieu de culture de cellules souches mésenchymateuses humaines (CSM) |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Supplémentation pour le milieu complet MSC |
| Pénicilline/Streptomycine | Life Technologies | 15070-063 | Supplémentation pour PBMC/leucocytes et MSC milieu complet |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | 1) Hyclone, pour la culture MSC ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; 2) Life Technologies, pour toutes les autres cellules (c’est-à-dire PBMC, populations leucocytaires spécifiques) | 1) SH30070.03M 2) 10091-148 | Lots de pré-test pour le support de la culture MSC in vitro |
| Plaque de culture cellulaire à 24 puits | Corning | COR3524 | Plaque de co-culture |
| Tube à centrifuger de 50 ml | Corning | 430291 | Isolation PBMC à partir de sang total par Ficoll-Paque PLUS |
| Tube à centrifuger de 15 ml ; | Corning | 430766 | Collection des fractions cellulaires marquées et non marquées |
| Tubes à fond rond | BD Falcon ; | 352008 | Prélèvement de cellules pour l’analyse cytométrique en flux |
Références
- Friedenstein, A. J. Precursor cells of mechanocytes. Int Rev Cytol. 47, 327-359 (1976).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Prockop, D. J.
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Réimpressions et autorisations
