Alla förfaranden är godkända av LSUHSC Institutional Animal Care och användning kommittén och genomfördes i enlighet med NIH "Principer för försöksdjurs vård." 1. Gnagare Acklimatisering och livsmedels begränsning Använd vuxna Wistar råttor som är 3 månader gamla i början av experimentet. Hus råttor ensamma i burar som är utrustade med ett laminärt flöde enhet och luftfilter i en temperatur- och fuktighetskontrollerad, AAALAC-ackrediterade djurvård anläggning på en omvänd 12-timmar ljus / mörker-cykel (belysningen på 0600 timmar). Tillhandahålla vatten och standard gnagarfoder fritt tills kroppsvikten är ungefär 380-400 g. Därefter livsmedels begränsa råttor och hålls kvar vid 85 till 90% av deras fria matning kroppsvikt under laborationer för att underlätta förvärv och underhåll av svar på metamfetamin. Hantera gnagare i hemmet buren rummet dagligen från ankomst under försökssessioner för att spela kroppsvikt och justera dagliga tilldelning. När målvikter uppnås, förbereda sig för att kirurgiskt implantera varje råtta med en kronisk kvar jugular kateter och intrakraniella stimulerande elektroder. 2. halsvenen Kateterisering Kateter Framställning Bered en 13-cm längd av silastic slang med en innerdiameter på 0,012 x 0,025 ", skapa en silikon boll 4 cm från en ände av slangen med användning av extra silikonslang och diatermi, och låt lufttorka. Doppa den andra änden av slangen i en limonen baserat lösningsmedel härrörande från citrus under några minuter och låt att expandera. Anslut den expanderade slangen till en rostfri kanyl böjd i en rät vinkel. Förankra bockade basen av det rostfria stålet guide kanyl till en 1 "fyrkant av biokompatibelt maskor med användning av dentala akrylcement. Spola katetern inifrån och ut med etanol och destillerat water. Spruta luft genom slangen för att eliminera kvarvarande vätskedroppar. Låt torka O / N. Steril teknik Utför alla operationer i en särskild djur kirurgisk svit med aseptisk kirurgisk teknik. Sterilisera instrument och implantat med hjälp av en autoklav och förbereda en steril område genom att placera vattenfast papper på ELLER bord täckt med en steril handduk (s). Bär sterila handskar och hålla alla instrument, implantat och kirurgisk gasbinda på det sterila området under proceduren. Torka varje instrument med en spritsudd följt av 20 sekunder i en pärla autoklav mellan förfaranden när flera operationer utförs. Anestesi Förbehandla råttor med atropin (sulfat) (0,04 mg / kg, sq) följt av pentobarbital (20 – 50 mg / kg, ip) för att uppnå anestesi. Injicera djur med steril penicillin G-prokain suspension (75.000 enheter, IM) och ett analgetiskt medel (karprofen, 5 – 10 mg / kg, se eller nadsoprofen, 2 – 5 mg / kg, se) omedelbart före kirurgi för att minska perioperativa infektioner och smärta, respektive. Kontrollera tillräcklig bedövning genom att leverera en måttlig tå nypa till djuret och, om inget svar inträffar, fortsätt sedan. Applicera ögon smörjmedel på båda ögonen. Kirurgisk Site Preparation Raka en 2 x 2 cm dorsal patch på råttans rygg bara posteriort en linje mellan skulderbladen. Raka en 1 x 1 cm ventral lapp i höger halsområdet mellan käkbenet och bröstbenet. Torka av rakade områden med spritsuddar följt av Betadine lösning. Placera råttan på en steril handduk och låt Betadine torka innan du fortsätter. Kateter Implantation Gör ett snitt parallellt med en linje som förbinder skulderbladen i midscapular regionen på baksidan med hjälp av en 10-kniv. Använd en hemostat för att separera huden från underliggande bindväv för att skapa en plan förmesh kateter bas. Skölj området med steril koksaltlösning och täck med steril gasbinda innan du startar råttan på rygg. Gör en diagonal snitt mellan höger käkbenet och bröstbenet med hjälp av en 10-kniv. Använd en hemostat för att separera huden från underliggande bindväv att lokalisera halsvenen. Obs! Halsvenen verkar vit / silver och blanka och är större hos hanråttor än hos kvinnor. Placera en spatel under venen, knyt en 4-0 silke sutur försiktigt runt den övre (proximala delen) av den exponerade venen och skjut venen tillbaka i halsen. Separera bindväv för att skapa en ytlig ficka under inferolateral nackskinn men framför muskeln. Tryck en steriliserad trokar från nacken snittet till midscapular snitt genom tunnling tillbaka bakom armen och uppåt. Kör katetern från baksidan till halsen genom att sätta in en styv styrtråd upp genom trokaren från halsänden och in i den distala katetern. Drastyrtråd tillbaka genom till halsen snitt och bifogade distala katetern kommer att följa. Isolera högra halsvenen över en spatel genom att dra upp den tidigare placerade proximala sutur. Använd en boll sax för att göra ett litet partiellt snitt på översidan av venen. Sätt en böjd pincett i venen snittet för att öppna den. Att hålla tången isär men på plats, passera kateterspetsen in mellan tångspetsarna och in i venen ungefär två – tre cm där det kommer avslutas utanför det högra förmaket. Säkra katetern genom att knyta en 4-0 silkesutur runt den distala ven. Knyt proximala och distala suturer tillsammans i en "låda" knut att lägga till extra stabilitet. Spola katetern med hepariniserad steril saltlösning och dra tillbaka blod för att bekräfta lyckad implantation. Trimma suturer 1 – 2 mm ovanför knutar och stoppa den återstående proximala katetern under nackskinnet. avsluta med en lämplig sutur / metod som du väljer. Om icke-absorbable suturer eller märlor används, måste de tas bort i 10-14 dagar under narkos. Täck snitt med antibiotisk salva med en steril bomullstopp. Förankra distala katetern / guide kanyl / maskenheten på subkutana tillbaka vävnad med hjälp av absorberbara suturer vid två av de motstående hörn av sängbotten. Stäng den bakre snittet runt styr kanylen med hjälp av avbrutna, icke-inverterad absorberbara suturer. Täck snitt med antibiotisk salva med en steril bomullstopp. Postoperativ vård Spola katetern med hepariniserad 0,9% steril koksaltlösning med användning av en 3 ml spruta och placera en obturator i styrkanylen för att förhindra igensättning. Spola varje råtta kateter på en daglig basis för att upprätthålla öppenhet. Omedelbart efter förfarande, placera råttan i sitt hem bur under en värmedyna i den kirurgiska sviten och observera tills medvetandet och spontan rörelse avkastning. Återgå den återvunna råttan till kolonin rummet och låta fem till sju dagar att passera innan intrakraniell operation. Väg, hantera och bedöma deras allmäntillstånd dagligen, inklusive kontroll av infektion och utvärdering av djurens beteende, utseende och aktivitetsnivå. Konsultera Animal Resources veterinär om det uppstår problem och följa rekommenderade behandlingsregimer. Injicera djur med ett analgetiskt medel (karprofen, 5 – 10 mg / kg, se eller ketoprofen, 2 – 5 mg / kg, se) att behandla perioperativ smärta efter behov. 3. Intrakraniell Elektrodplacering Kirurgisk förberedelse Utför alla operationer under sterila villkor som beskrivs i avsnitt 2.2. Anestesi Placera djur i en anestesiinduktionskammare samt tillhandahålla isoflurance gasflödet in i kammaren vid 1000 – 2000 ml / min med förångaren satt till 5%. När djuret är tillbakalutad, ta bort från kammaren ena plats i noskonen på vadderade stereotaktisk operativ plattform. Växla gasflödet från kammaren till noskonen och köra gas med förångaren inställd på 2-3%. Justera förångare efter behov för att bibehålla stabila andetag och inget svar på stimulering under kirurgi. Injicera råtta med steril penicillin-G prokain suspension (75.000 enheter, im) och ett smärtstillande medel (buprenorfin 0,05 till 0,5 mg / kg sc) omedelbart före operation för att minska perioperativa infektioner och smärta, respektive. Kontrollera tillräcklig bedövning genom att leverera en måttlig tå nypa till djuret och, om inget svar inträffar, fortsätt sedan. Applicera ögon smörjmedel på båda ögonen. Kirurgisk Site Preparation Raka toppen av råttans huvud och placera råttan i örat barer att hålla huvudet stilla under förfarandet. Torka av rakade området med spritsuddar följt av Betadine lösning. Låt Betadine torka innan du fortsätter. Elektrod Implantation Ta tag i hårbotten mellan och något anterior till öronen med pincett och använda sax för att klippa över basen. Denna manuveur kommer att ta bort en 1,5 x 1 cm stort område av huden över mitten av skallen. Använd en 10-blad för att göra en omkrets snitt genom HUVUDSKÅLSHINNA ner skallen och en böjd pincett att skrapa bort och avlägsna HUVUDSKÅLSHINNA. Skölj området med steril saltlösning, sandskädda överskott av blod och salin med gasbinda, och låta skallen torka helt så beniga landmärken, inklusive bregma, kan tydligt ses. För bilaterala kirurgi, montera två bipolära platina iridium elektroder, en in i varje elektrodhållare på vardera sidan av den stereotaktiska operativ plattform. Flytta den första elektroden på plats ~ 1 mm över bregma och skriva ner stereotaktiska koordinaterna för anterior-posterior (AP) och mediala-laterala (ML) positioner, som kommer att visas på den digitala displayen. INTE faktiskt röra elektrodspetsen till skUll eftersom elektroden inte längre att fungera. Upprepa proceduren för den andra elektroden. Beräkna den slutliga AP och ML koordinater bygger på målet strukturen av intresse. Flytta elektroden till denna position med spetsen precis ovanför skallen för att erhålla den grundläggande dorsoventral (DV) koordinat på den digitala displayen. Beräkna den slutliga DV djupet baserat på målet strukturen av intresse. Obs: nucleus accumbens skalet var riktad i detta exempel med tanke på dess kända inblandning i narkotika consummatory beteende 8 med följande stereotaktiska koordinater i förhållande till bregma: AP inträde samordna = [Digital visas koordinat bregma] + 1,6 ML inträde koordinaten = [Digitalt visas koordinat bregma] ± 2,4 för höger / vänster DV djup = [Digital visas koordinat skallen ytan på AP / ML posten] – 8,5 Märk den projicerade ingångsläget för varje elektrod på ytan av skallen med en permanent maRKER. Inte stöta eller rör elektrodens spets under denna manöver. Använd en rund boll diamantbelagd Burr att borra ett 1,4 mm hål vid varje markering. Var noga med att inte störta genom skallen i intrakraniell valvet med höghastighetsborr. Använd en böjd pincett att punktera dura när skallen har borrats bort. Använd en rund boll diamantbelagd Burr att borra 0,7 mm hål i ytterligare fyra platser bakom elektrodposter för placering av skallen skruvar. Använd en manuell skruvmejsel för att placera fyra 0,8 (diameter) x 3,2 (längd) mm rostfria skruvar i skallen, två på vardera sidan om mittlinjen. Tätt säkra dessa skruvar upp till ungefär halva sin längd i skallen, eftersom de är de stora infrastrukturprojekt som kommer att hålla hjärn locket på plats för de kommande veckorna och månaderna. Försiktigt in den första elektroden genom sin burrhole in i hjärnan till det beräknade DV djupet genom att manuellt vrida ratten som hanterar Z-koordinatelektrodhållaren. Vrid ratten med en hastighet ungefär lika med 1/2 varv per sekund för att förhindra onödig skada på spetsen på elektroden. Se till elektrodspetsen inte vidrör den beniga kanten på burrhole vid inträdet i hjärnan. Fäst den första elektroden med hjälp av superlim lager över burrhole och bakre skruvarna, följt av dentalcement. När denna konstruktion har torkat helt, ta bort elektroden från hållaren. Upprepa införing och cementeprocess för den andra elektroden. Applicera dentalcement ända fram till kanten huden men överlappar inte med huden eftersom detta lossar kraniala cementlocket långsiktigt. Postoperativ vård Placera två dammskydd över elektrod piedestaler för att förhindra igensättning. Omedelbart efter förfarande, placera råttan i sitt hem bur under en värmedyna i den kirurgiska sviten och observera tills medvetandet och spontan rörelse avkastning. Återgå den återvunna råttan till the koloni rum och låta fem dagar att passera innan försöket. Väg, hantera och bedöma råttornas allmäntillstånd dagligen, inklusive kontroll av infektion och utvärdering av djurens beteende, utseende och aktivitetsnivå. Konsultera Animal Resources veterinär om det uppstår problem och följa rekommenderade behandlingsregimer. Injicera djur med ett smärtstillande medel (buprenorfin 0,05-1 mg / kg se) att behandla perioperativ smärta efter behov. Intrakraniell blödning kan vara vanligare med användning av icke-steroida smärtstillande medel (carprofen, 5-10 mg / kg, sc eller ketoprofen, 2-5 mg / kg, SC) så använd buprenorfin perioperativt för intrakraniell operation. 4. Operant Apparat Använda plast och rostfritt stål operant konditionekammare som finns i ljuddämpande höljen att köra beteendeexperiment. Utrusta varje kapsling med en frånluftsfläkt för att leverera ventilation och vitt noiSE för att maskera främmande ljud. Använd en personlig dator och en beteendeprogramvarugränssnitt system för att programmera de förfaranden och samla experimentella data. General Set-Up Utrusta varje experimentell kammare med två svarsspakar monterade på en vägg hos kammaren med en stimulans ljus belägen ovanför varje hävarm. Utse en av spakarna den "aktiva" spaken så att det resulterar i en programmerad följd när man trycker. Programmera en stimulans ljus ligger direkt ovanför den aktiva spaken svaret för att lysa under varje operant session som anger tillgängligheten av läkemedlet. Har ett svar på den aktiva spaken resulterar i en infusions leverans av metamfetamin (0,05 mg / kg / infusion i 100 pl 0,9% NaCl) under 2,8 sekunder tillsammans med huset ljus på den motsatta väggen pågått i fem sekunder och stimulans ljus går FRÅN för en 30-sek-timeout. Räkna svar på den aktiva spaken men de bör ha någon planerad konsekonsekvenser under 30 sek tidsgräns. Fylls bör rekord svaren på den inaktiva spaken men de har inga schemalagda konsekvenser. 5. Intravenös (IV) Metamfetamin Själv tvångsförvaltning Allmänna Beredningar Last råttor i operant kammare så snabbt och lugnt som möjligt för att minimera beteende artefakter. Bifoga en rostfri stålfjäder koppel till guiden kanylen på gnagare rygg och en läckagesäker vätska vrid upphängd ovanför operant kammaren. Säkerställa integriteten hos anslutningsslangen från sviveln till 20-ml läkemedels sprutan i en motordriven pump placerad utanför ljuddämpande hölje. För att göra detta, tryck plastanslutningsslangen minst en fjärdedel av en tum på metallvrid spetsen och läkemedelssprut nålspetsen tills det inte kommer att glida ut med måttlig dra. Motvikt vrid och koppel enheten för att tillåta relativt ohämmad movement av djuret. Genomföra operant sessioner vid ungefär samma tid varje dag måndag till fredag. Förvärv För att underlätta en snabb förvärv av IV metamfetamin självadministration, kör råttor på dagliga 6-hr tillfällen för fyra till fem dagar i följd. Genomför dessa sessioner på en fast förhållande FR-1 + 30 sek schema för reinforcementduring som råttor får en infusion av IV metamfetamin för varje tryckning på den aktiva spaken följt av en 30 sek time-out (t.ex. ingen kö eller belöna konsekvenserna uppstå med att trycka av endera spaken). Obs: Denna inledande långvarig och "lätt" tillgång kommer att resultera i de flesta gnagare förvärva betydande drogbeteende på mindre än eller lika med en vecka (Figur 3). Underhåll Under andra veckan i utbildning, att köra råttor på dagliga 2-hr sessioner måndag till fredag upprätthålla och förbättra IV methamphetamine självadministrering. Genomföra sessioner på en fast förhållande FR-1 + 30 sek timeout schema för förstärkning. Dokumentera stabil, intensiv svara när det totala antalet metamfetamin presentationer över varje session varierar mindre än 10% under tre sessioner (Figur 4) och den kumulativa antalet infusioner över den första 30-min är större än den sammanlagda antalet infusioner under andra 30-min (Figur 5). Notera: Detta kriterium gör att råttorna utveckla ett läkemedel-lastningsmönster i början av sessionen som indikerar missbruksbeteende 19 och inte bara tillfällig användning. Post-session Vid slutet av varje session, koppla bort koppel från gnagare rygg. Spola katetern med 0,1 ml 0,9% koksaltlösning innehållande 800 IU streptokinas för att förhindra blodproppar. Sätt en obturator i varje styr kanyl för att förhindra igensättning innan han återvände rats till hemburar. Testa öppenheten hos katetrarna omedelbart efter slutet av varje experimentell session på onsdagar under hela experimentets förlopp. Förbered en 3 cc spruta med en 22 G nål, innehållande heparin bakteriostatisk saltlösning för att testa kateter öppenhet. Fäst ena änden av en 4-6 tum lång bit av plaströr till nålen och den andra änden till metall posten som kateterkanylenheten på djurets rygg. Ingjuta 0,1 till 0,2 ml koksaltlösning för att säkerställa en tydlig flöde och dra sedan sprutkolven tillbaka. Om katetern är patent bör det både spola lätt och dra tillbaka blod som kommer att vara synlig i slangen. Släpp kolven och ingjuta ytterligare 0,2 ml för att skölja alla av blodet tillbaka genom katetern. Om blodet inte kan återkallas, sedan bort 3 cc spruta och slang från metall stolpen. Bered en 1 cc spruta med en 22 G nål, innehållande metohexital natrium, en snabbverkandebedövningsmedel, för att ytterligare prov kateter patency. Fäst ena änden av en 4-6 tum lång bit av plaströr till nålen och den andra änden till metall posten som kateterkanylenheten på djurets rygg. Ingjuta 1,5 mg och snabbt ta bort en cc spruta och slang den från metall post på djurets rygg. Anslut 3 cc spruta fylld med hepariniserad bakteriostatisk saltlösning och ingjuta 0,1 – 0,2 ml. Om djuret förlorar muskeltonus inom 3 sekunder, då katetern är patent- och funktionell. Se Tilläggs File "vanliga fallgropar" för ett avsnitt fallgropar som behandlar biverkningar metamfetamin, underlåtenhet att förvärva metamfetamin självadministration och råtta utvinning svårigheter. 6. Brain Stimulation Apparatus Använd 10 till 12 plexi-glasrutor (12 x 18 x 18 tum) (BxHxD) att köra DBS experiment. Täck varje ruta på utsidan med Stiff ogenomskinligpapper som täcker ryggen och sidorna av lådan för att förhindra råttorna från att visa eller interagera med varandra. Låt klart frontglas avslöjade så att examinator kan se djuren under stimuleringssessioner. Täck topparna av rutorna med ett semipermeabelt panel som förhindrar råttorna från att fly samtidigt som luftflödet. Använd den här panelen för att stödja de kommutatorer som är belägna ovanför varje ruta för att underlätta den elektriska anslutningen mellan gnagare head cap och stimuleringssystemet. Använd ett stimuleringssystem som kan leverera konstant ström till flera samtidiga djur för DBS experiment. Använd ett system som består av en användare programmerbar digital signalprocessor / kommunikationsgränssnitt, en stimulator, en stimulator batteripaket, en kanal splitterbox, och den medföljande programvara (Se arkmaterial). Använd kablar anpassade längd för att ansluta stimulator kanal hamnar till den överlägsna elektroniska piedestal av varje commutateller. Obs: Den längd som behövs kommer att bero på det enskilda laboratoriet. Dessa kablar är utanför djurområdet och behöver inte tas upp i rostfritt fjäderstål. Anslut sämre elektronisk piedestal av kommutatorn till den implanterade elektroden piedestal på gnagare huvud mössa med hjälp av 16-kablar täckta med rostfritt fjäderstål. Se till att kablarna är tillräckligt långa för att möjliggöra fri rörlighet för varje område av inneslutningen utan väsentlig spänning på head cap. Obs: En kabel som slutar ungefär där chefen för råttan skulle vara när man står på alla fyra fötterna är oftast tillräcklig. Brain Stimulation Programmering Använd en personlig dator och programmering programvara för att programmera stimuleringsparametrar (t.ex. vågform, frekvens, pulsbredd, inter-stimulus dröjsmål strömamplitud) och samla de experimentella data. Med användning av en visuellt programmeringsspråk, anger vilka funktioner varje enhet kommer att utföra för att uppfylla de experimentala endpoints och vilka data kommer att lagras och / eller planerad för visning i realtid. De kommandon som kör just detta projekt är visas i figur 1. Ange den önskade frekvensen, pulsbredd och amplitud i det synliga manöverpanelen (fig 2) före starten av experimentet. Typiska parametrar för högfrekvent stimulering i råttor liknar dem som används i klinisk humant djup hjärnstimulering: frekvens av 130 till 180 Hz, pulsbredd på 60 till 90 ms, och strömamplituden av 100 till 250 | iA 4,8-10. Anmärkning: En lägre ström används i gnagare på grund av dess reducerade storleken jämfört med den primat. 7. Deep Brain Stimulation ordningen Så här fyller du råttor i rutorna, fästa fjäder i rostfritt stål kabel från kommutatorn till varje elektrod piedestal på huvudet cap. Testa impedansen hos varje elektrod genom att köra 5 ^ A av ström vid en frekvens1000 Hz för 2 sek. Om impedansen är lika med eller mindre än 125 KOhm, fortsätt sedan med experimentet eftersom elektroden kan leverera terapeutisk stimulering. Om impedansen är större än 125 KOhm, överväga att ta bort djuret från experimentet på grund av att elektrodens höga resistens kan trunkera strömmen till potentiellt subterapeutiska nivåer. Kör råttorna genom en eller två mock sessioner för tillvänjning under vilken de kommer att knytas till elektrodkabeln (s) men inte får någon aktiv behandling. Mock tester kommer att eliminera alla icke-specifika beteendeeffekter. Omedelbart efter varje mock session, transport råttorna till operant rutorna för den dagliga 2-timmars session IV metamfetamin självförvaltning. Motvikt råttor i två grupper, en aktiv stimulering och en bluff-stimulerings kohort så att baslinjen läkemedelsintag är ingen signifikant skillnad mellan grupperna. Utför daglig DBS sessionens på gnagare kohorten i 5 dagar under vilken de får antingen aktiv elektrisk hjärnstimulering eller ingen stimulering för 3 timmar beroende på grupparbete. Omedelbart efter varje DBS session, transport råttor operant rutorna för den dagliga 2-timmars session IV metamfetamin självförvaltning. Observera djur noga under åtminstone en del av varje DBS session för att säkerställa att stimulering inte orsakar tydliga förändringar i djurens beteende. Om några onormala beteenden inträffar under / efter stimulering, vara noga med att dokumentera dessa iakttagelser. Obs: Författarna har inte märkt betydande beteendeförändringar eller förändringar i livsmedel / vattenintag under försöket som beskrivs i den här artikeln. Ändra längden av DBS behandling, de elektriska parametrarna, och tiden mellan DBS session och operant sessionen efter behov beroende på hypotesen.