Alle prosedyrer er godkjent av LSUHSC Institutional Animal Care og bruk komité og ble utført i samsvar med NIH "Prinsipper for forsøksdyr omsorg." 1. gnager Akklimatisering og mat begrensning Bruk voksne Wistar-rotter, som er 3 måneder gamle ved starten av forsøket. Hus rotter enkeltvis i bur utstyrt med en laminær enhet og luftfilter i en temperatur- og fuktighetskontrollerte, AAALAC-akkreditert dyr omsorg anlegget på en reversert 12-timers lys / mørke syklus (lysene av på 0600 timer). Gi vann og standard gnagerfor fritt til kroppsvekt er ca 380-400 g. Deretter ble næringsmiddel begrenser rotter og opprettholde på 85 til 90% av deres frie fore kroppsvekt i løpet av den eksperimentelle sesjoner for å lette anskaffelse og vedlikehold av respons på metamfetamin. Håndtak gnagere i hjemmet buret rommet daglig fra ankomst gjennom hele forsøksøkter for å ta kroppsvekt og justere daglige mat tildeling. Når målet vekter er oppnådd, forberede seg til kirurgisk implantat hver rotte med en kronisk inneliggende vena kateteret og intrakranielle stimulerende elektroder. 2. jugularvenen Kateterisering Kateter Forberedelse Tilbered en 13 cm lengde av silastinrør med en indre diameter på 0,012 x 0,025 ", skaper et silikon ball 4 cm fra den ene enden av slangen ved hjelp av ekstra silikonslanger og elektrokirurgi, og la det lufttørke. Dypp den andre enden av slangen i en limonen-basert løsningsmiddel avledet fra sitrus i noen minutter og tillater å ekspandere. Koble ekspanderte rør til en rustfri stål guide kanyle bøyd i rett vinkel. Forankre den bøyde basis av rustfritt stål guiden kanyle til en en "firkant av biokompatibelt mesh ved hjelp av dental akrylsement. Skyll kateteret inne og ute med etanol og destillert water. Injiser luft gjennom røret for å fjerne gjenværende væskedråper. La det tørke O / N. Steril teknikk Utføre alle operasjoner i et dedikert dyr kirurgisk suite ved bruk av aseptisk kirurgiske teknikker. Sterilisere instrumenter og implantater under anvendelse av en autoklav, og fremstille et sterilt område ved å plassere vannfast papir på OR bordet er dekket med et sterilt håndkle (s). Bruk sterile hansker og holde alle instrumenter, implantater og kirurgisk gasbind på sterilt område under prosedyren. Tørk av hvert instrument med en spritserviett fulgt av 20 sek i en perle sterilisator mellom prosedyrer når flere operasjoner utføres. Anestesi Forbehandle rotter med atropin (sulfat) (0,04 mg / kg, sq), fulgt av pentobarbital (20 – 50 mg / kg, ip) for å oppnå anestesi. Injisere dyr med steril penicillin G prokain suspensjon (75.000 enheter, im) og et smertestillende middel (carprofen 5 – 10 mg / kg, sc eller markedetoprofen, 2 – til 5 mg / kg sc) umiddelbart før det kirurgiske inngrepet redusere infeksjoner og perioperativ smerte, henholdsvis. Sjekk for tilstrekkelig anestesi ved å levere en moderat tå klype til dyret, og hvis det ikke kommer noe, så fortsette. Påfør øye smøremiddel til begge øynene. Kirurgisk klargjøring Barbere en 2 x 2 cm rygg patch på rotte tilbake bare posterior til en linje som forbinder skulderbladene. Barbere en 1 x 1 cm ventral lapp i riktig nakkeregionen mellom kjevebeinet og brystbenet. Tørk av barbert områder med alkohol pads fulgt av Betadine løsning. Plasser rotte på et sterilt håndkle og la betadine tørke før du fortsetter. Kateter Implantasjon Lag et snitt parallell til en linje som forbinder skulderbladene i midscapular regionen på baksiden ved hjelp av en 10-blad kniv. Bruk en hemostat å skille skinnet fra det underliggende bindevev å opprette en plan formesh kateter basen. Skyll området med sterilt saltvann og dekk med sterilt gasbind før du slår rotta på ryggen. Lag en diagonal snitt mellom høyre kjevebeinet og brystbenet ved hjelp av en 10-blad kniv. Bruk en hemostat å skille skinnet fra det underliggende bindevev å lokal vena jugularis. Merk: jugularvenen vises hvit / sølv og skinnende og er større hos hannrotter enn hos kvinner. Plasser en slikkepott under vene, knyt en 4-0 silke sutur forsiktig rundt toppen (proksimale del) av den eksponerte venen og skyv vene tilbake inn i halsen. Separer bindevev for å skape en overfladisk lomme under Inferolaterale halsen huden, men over muskelen. Presse en sterilisert trocar fra nakken snittet til midscapular snittet av tunnel tilbake bak armen og oppover. Kjør kateteret fra baksiden til halsen ved å sette inn en stiv guidekabel opp gjennom trokaren fra halsenden og inn i den distale kateteret. Trekkguidekabel tilbake gjennom til halsen snitt og den vedlagte distal kateter vil følge. Isolere høyre halsvenen over en slikkepott ved å trekke opp på tidligere plassert proksimale sutur. Bruk en ball saks for å lage en liten delvis kutt på oversiden av venen. Sett inn en buet pinsett inn i venen snitt til å åpne den opp. Holde tang fra hverandre, men i stedet, passerer kateterspissen i mellom tang tips og inn i venen ca 2 – 3 cm hvor det vil avslutte utenfor høyre forkammer. Fest kateteret ved å binde en 4-0 silke sutur rundt distal blodåre. Knytte de proksimale og distale suturer sammen i en "boks" knute for å legge til ekstra stabilitet. Skyll kateteret med heparinisert sterilt saltvann og trekke tilbake blod for å bekrefte vellykket implantasjon. Trim sting 1 – 2 mm over knutene og putt den gjenværende proksimale kateteret under halsen huden. lukke med en passende sutur / metode som du selv velger. Hvis ikke-absorbable sting eller stifter brukes, må de bli fjernet i 10-14 dager under narkose. Dekk såret med antibiotisk salve med en steril bomullstupp applikator. Forankre distal kateter / guide kanyle / mesh enheten til subkutan tilbake vev ved hjelp av absorberbare suturer på to av de motstående hjørnene av mesh basen. Lukk tilbake snitt rundt guiden kanylen ved hjelp avbrutt, ikke-invertert absorberbare suturer. Dekk såret med antibiotisk salve med en steril bomullstupp applikator. Postoperativ Care Skyll kateter med heparinisert 0,9% steril saltoppløsning ved bruk av en 3 ml sprøyte og plassere en obturator i førings kanylen for å hindre tilstopping. Skyll hver rotte kateter på daglig basis for å opprettholde åpenhet. Umiddelbart etter inngrepet, plasserer rotte i sitt hjem buret over en varmepute i kirurgisk suite og observere til bevissthet og spontan bevegelse retur. Returner utvinnes rotte til kolonien rommet og la fem til sju dager å passere før intrakraniell kirurgi. Vei, håndtak, og vurdere deres generelle tilstand daglig, inkludert kontroll for infeksjon og evaluering av dyr atferd, utseende og aktivitetsnivå. Konsultere Animal Resources veterinær hvis det oppstår problemer og følge alle anbefalte behandlingsregimer. Injisere dyrene med et smertestillende middel (carprofen, 5 – 10 mg / kg, sc eller ketoprofen med 2 – 5 mg / kg, sc) for å behandle perioperativ smerte etter behov. 3. Intrakraniell elektrodeplassering Kirurgisk Forberedelse Utføre alle operasjoner under sterile forhold som beskrevet i punkt 2.2. Anestesi Plasserer dyret i et anestesikammer induksjon, og gir isoflurance gass-strømmen inn i kammeret ved 1000 – 2000 ml / min med fordamperen satt til 5%. Når dyret er tilbakelent, fjern fra kammeret ennd plassere i nesen membran på polstret stereodriftsplattform. Veksle gasstrøm fra kammer til nesekonusen og drives med gass fordamper innstilt på 2 – 3%. Juster vaporizer som nødvendig for å opprettholde stabile respirasjon og ingen respons på stimulering under operasjonen. Injisere rotte med sterilt penicillin G procain suspensjon (75.000 enheter, im) og et smertestillende middel (buprenorfin 0,05 til 0,5 mg / kg sc) umiddelbart før kirurgi for å redusere infeksjoner og perioperativ smerte, henholdsvis. Sjekk for tilstrekkelig anestesi ved å levere en moderat tå klype til dyret, og hvis det ikke kommer noe, så fortsette. Påfør øye smøremiddel til begge øynene. Kirurgisk klargjøring Barbere toppen av rotte hode og plasser rotte i øret barer å holde hodet i ro under prosedyren. Tørk det barberte området med alkohol pads fulgt av Betadine løsning. La betadine tørke før du fortsetter. Elektrode Implantasjon Ta tak i hodebunnen mellom og litt fremre til ørene med pinsett og bruke saks til å klippe over basen. Dette manuveur vil fjerne en 1,5 x 1 cm område av huden over midten av skallen. Bruk en 10-kniv for å lage en omkrets snitt gjennom pericranium ned til skallen og en buet pinsett til å skrape av og fjern pericranium. Skyll området med sterilt saltvann, DAB overflødig blod og saltvann med gasbind, og la skallen tørke helt så beinlandemerker, inkludert bregma, kan tydelig ses. For bilateral kirurgi, montere to bipolare platina-iridium elektroder, en hver elektrodeholder på hver side av den stereotaktiske driftsplattform inn. Flytt den første elektroden på plass ~ 1 mm over bregma og skrive ned de stereotaktiske koordinatene for anterior-posterior (AP) og medial-lateral (ML) posisjoner, som vil bli vist i det digitale displayet. IKKE faktisk touch elektrodespissen til skull fordi elektroden vil ikke lenger fungere. Gjenta denne fremgangsmåten for den andre elektroden. Beregner de endelige AP og ML-koordinater basert på målet strukturen av interesse. Flytt elektroden til denne stillingen med spissen rett over skallen for å få den første dorsoventral (DV) koordinere på det digitale displayet. Beregner de endelige DV dybde basert på målet strukturen av interesse. Merk: nucleus accumbens skallet ble rettet i dette eksempelet gitt sin kjente engasjement i narkotika-consummatory atferd 8 ved hjelp av følgende stereotactic koordinater i forhold til bregma: AP oppføring koordinere = [Digitally vises koordinere på bregma] + 1.6 ML oppføring koordinat = [Digitally vises koordinere på bregma] ± 2,4 for høyre / venstre DV dybde = [Digitally vises koordinere på skallen overflaten på AP / ML entry] – 8.5 Markere beregnet posisjon oppføring av hver elektrode på overflaten av hodet med en permanent marker. Ikke bump eller berøre elektroden tips under denne manøveren. Bruk en rund ball diamantbelagt Burr å bore et 1,4 mm hull i hvert merke. Vær forsiktig med å stupe gjennom skallen inn i intrakraniell hvelv med høy hastighet drill. Bruk en buet pinsett til å punktere dura når skallen er boret unna. Bruk en rund ball diamantbelagt Burr å bore 0,7 mm hull i ytterligere fire steder bak elektrode oppføringer for plassering av skallen skruer. Bruk en manuell skrutrekker til å plassere fire 0,8 (diameter) x 3,2 (lengde) mm rustfrie skruer inn i skallen, to på hver side av midtlinjen. Tett sikre disse skruene opp til omtrent halve lengden inn i skallen fordi de er den viktigste infrastrukturen som vil holde kranie hetten på plass for de kommende ukene og månedene. Sett forsiktig den første elektrode gjennom sin burrhole inn i hjernen til den beregnede DV dybde ved å manuelt vri på bryteren som styrer Z-koordinat forelektrodeholderen. Drei knotten med en hastighet omtrent lik en halv omdreining per sekund for å unngå unødig skade på tuppen av elektroden. Kontroller at elektrodespissen ikke berører benete kanten av burrhole når inn i hjernen. Sikre første elektrode bruker superlim lagvis over burrhole og de bakre skruene, etterfulgt av dental sement. Når denne konstruksjonen har tørket helt, fjern elektroden fra holderen. Gjenta innføring og sementering for den andre elektrode. Påfør dental sement helt opp til huden kanten, men ikke overlapper med huden fordi dette løsner kranie sement cap langsiktig. Postoperativ Care Plasser to støvhette over elektrode pidestaller for å hindre tilstopping. Umiddelbart etter inngrepet, plasserer rotte i sitt hjem buret over en varmepute i kirurgisk suite og observere til bevissthet og spontan bevegelse retur. Returnere den gjenopprettede rotte til the koloni rom og tillate fem dager for å passere før start av eksperimentet. Vei, håndtak, og vurdere rottenes allmenntilstand daglig, inkludert kontroll for infeksjon og evaluering av dyr atferd, utseende og aktivitetsnivå. Konsultere Animal Resources veterinær hvis det oppstår problemer og følge alle anbefalte behandlingsregimer. Injisere dyrene med et smertestillende middel (buprenorfin 0,05 til 1 mg / kg sc) for å behandle perioperativ smerte etter behov. Intrakranielle blødninger kan være mer utbredt med bruk av ikke-steroide smertestillende medikamenter (carprofen 5 – 10 mg / kg, sc eller ketoprofen 2 – 5 mg / kg, sc) så bruk buprenorfin perioperatively for intrakraniell kirurgi. 4. Operant Apparatus Bruk plast og rustfritt stål operant betinging kamre inne i lyd dempende kabinetter for å kjøre de atferdsmessige eksperimenter. Utstyre hvert kabinett med en avtrekksvifte for å levere ventilasjon og hvit noise å maskere fremmede lyder. Bruke en personlig datamaskin og en adferdsprogramvaregrensesnitt system for å programmere de prosedyrer og samle de eksperimentelle data. Generelt Set-Up Utstyre hver forsøks kammer med to respons-spaker som er montert på en vegg av kammeret med en stimulus lys plassert over hver spak. Utpeke en av spakene den "aktive" spaken slik at det resulterer i en programmert konsekvens når trykket. Programmere en stimulus lys plassert direkte over aktive respons spaken for å belyse under hver operant økt, noe som indikerer tilgjengeligheten av stoffet. Ha en respons på det aktive spaken resultat i en infusjon levering av metamfetamin (0,05 mg / kg / infusjon i 100 ul 0,9% NaCl) i løpet av 2,8 sek ledsaget av huset lyset på den motsatte veggen som skjer i 5 sek og stimulus lys som går OFF for en timeout 30-sek. Telle svar på den aktive spaken, men de bør ikke ha planlagt konsekonsekvenser i løpet av 30-sek timeout perioden. For ferdigstillelse, bør rekord svarene på inaktive spaken, men de har ingen planlagte konsekvenser. 5. Intravenøs (IV) Metamfetamin Self-Administration Prosedyre Generelle Forberedelser Last rotter i driftsavdelingene som raskt og rolig som mulig for å minimalisere atferds gjenstander. Fest en rustfri stålfjær bånd til føringskateteret på gnagere rygg og til en lekkasjesikker fluidsvivel opphengt over operant kammeret. Sikre integriteten av forbindelsen slangen fra svivelen til 20-ml sprøyte medikament i en motordrevet pumpe plassert på utsiden av lyden dempende kabinett. For å gjøre dette, skyv plast forbindelse slangen minst ¼ av en tomme på metall svivel tips og stoffet sprøyte nålespissen før det ikke vil gli av med moderat trekking. Counter-balansere svivel og line montering for å tillate relativt uhemmet movement av dyret. Gjennomføre operant økter på omtrent samme tid hver dag mandag til fredag. Oppkjøp For å lette raske oppkjøp av IV metamfetamin selvadministrering, kjøre rotter på daglige 6-timers økter for fire til fem påfølgende dager. Gjennomføre disse øktene på en fast ratio FR-1 + 30 sek tidsplan for reinforcementduring som rotter motta én infusjon av IV metamfetamin for hvert trykk på den aktive spaken etterfulgt av en 30 sek time-out (f.eks ingen kø eller belønne konsekvenser oppstå med å trykke av enten spak). Merk: Denne første langvarig og "lett" tilgang vil resultere i de fleste gnagere anskaffe betydelig narkotikabruk atferd i mindre enn eller lik en uke (figur 3). Vedlikehold Under den andre uken av trening, for å kjøre rotter på daglig to-timers økter mandag til fredag å opprettholde og videreutvikle IV methamphetamine selvadministrering. Gjennomføre økter på en fast ratio FR-1 + 30 timeout sek tidsplan av armering. Dokument stabil, sterk respons når det totale antall av metamfetamin presentasjoner på tvers av hver sesjon varierer mindre enn 10% for tre påfølgende sesjoner (figur 4) og det kumulative antall infusjoner over den første 30-min er større enn den kumulative antall infusjoner under andre 30-min (figur 5). Merk: Dette kriteriet sikrer at rottene utvikle et medikament-lasting mønster i begynnelsen av økten som indikerer vanedannende oppførsel 19 og ikke bare tilfeldig bruk. Post-Session På slutten av hver økt, kobler bånd fra gnager rygg. Skyll kateteret med 0,1 ml 0,9% saltoppløsning som inneholder 800 IE streptokinase å forebygge blodpropp. Sett inn et tetningsmiddel i hver guide kanyle for å hindre tilstopping før du returnerer rats til hjemmet bur. Test åpenheten av katetere umiddelbart etter slutten av hver forsøkssesjon på onsdag i løpet av forsøket. Forbered en 3 cc sprøyte med en 22 G nål, inneholder hepariniseres bakteriostatisk saltvann for å teste kateter åpenhet. Feste den ene enden av en 4 til 6 tommers langt stykke av plastrør til nålen, og den andre enden til metallet etter av kateteret-kanylesammenstillingen på dyrets rygg. Sette mot 0,1 til 0,2 ml saltvann for å sikre en klar flyt og deretter trekke sprøytestempelet tilbake. Hvis kateteret er patent, bør det både flush lett og trekke tilbake blod som vil være synlig i slangen. Slipp stempelet og sette ytterligere 0,2 ml å skylle alt blodet tilbake gjennom kateteret. Hvis blodet ikke kan trekkes tilbake, og deretter fjerne tre cc sprøyte og slange fra metallet innlegg. Forbered en 1 cc sprøyte med en 22 G nål, som inneholder metoheksitalnatrium, en hurtigvirkendebedøvelse, for ytterligere å teste kateter åpenhet. Feste den ene enden av en 4 til 6 tommers langt stykke av plastrør til nålen, og den andre enden til metallet etter av kateteret-kanylesammenstillingen på dyrets rygg. Sette mot 1,5 mg og raskt fjerne en cc sprøyte og slange fra metallet innlegg på dyrets tilbake. Koble til 3 cc sprøyte fylt med heparinisert bakteriostatisk saltvann og sette mot 0,1 – 0,2 ml. Hvis dyret taper muskeltonus i løpet av 3 sekunder, og kateteret er patentet og funksjonell. Se Opplysning File "vanligste fallgruvene" for en fallgruver seksjon som tar for bivirkninger av metamfetamin, unnlatelse av å skaffe metamfetamin selvadministrasjon, og rotte utvinning vanskelighetsgrad. 6. hjernestimulering Apparatus Bruk 10 til 12 plexi-glass, bokser (12 x 18 x 18 tommer) (BxHxD) å kjøre DBS eksperimenter. Dekke hver boks på utsiden med stiv ugjennomsiktigpapir som dekker baksiden og sidene av boksen for å hindre rottene fra å vise eller i samspill med hverandre. La den klare frontpanelet avdekket slik at sensor kan se dyrene under stimulering økter. Dekker toppene av boksene med en semi-permeabel panel som hindrer rottene fra å unnslippe samtidig som luftstrømmen. Bruk av dette panel for å støtte de kommutatorer som er plassert over hver boks for å lette den elektriske forbindelse mellom den gnager hodehetten og stimuleringssystem. Bruk en stimulering system som kan levere konstant strøm til flere samtidige dyr for DBS eksperimenter. Bruke et system som består av en bruker programmerbar digital signalprosessor / kommunikasjonsgrensesnitt, en stimulator, en stimulator batteripakke, en kanal splitter boksen, og den medfølgende programvaren (Se Materialer Sheet). Bruk egendefinert lengde kabler for å koble stimulatorer kanalporter til overlegen elektronisk pidestall av hver commutateller. Merk: Lengde nødvendig vil avhenge av den enkelte laboratoriet. Disse kablene er ute av dyret området og behøver ikke å være dekket i rustfritt stål våren. Koble dårligere elektronisk pidestall av kommutatoren til den implanterte elektroden pidestall på gnager hode cap med 16-in-kabler dekket med rustfritt stål våren. Kontroller at kablene er lange nok til å tillate fri bevegelighet til alle områder av kabinettet uten betydelig spenning på hodet cap. Merk: En kabel som ender omtrent der hodet av rotte ville være når du står på alle fire beina er vanligvis tilstrekkelig. Hjernestimulering Programming Bruk en personlig datamaskin og programmering programvare for å programmere stimuleringsparametere (f.eks kurve, frekvens, pulsbredde, inter-stimulus forsinkelse, gjeldende amplitude) og samle de eksperimentelle data. Ved hjelp av en visuell programmeringsspråk, spesifisere hvilke funksjoner hver enhet skal utføre for å møte experimentale endepunkter og hvilke data vil bli lagret og / eller prosjektert for visning i sanntid. Kommandoene som kjører dette prosjektet er vist i figur 1. Spesifisere ønsket frekvens, pulsbredde og amplitude til den visuelle kontrollpanel (figur 2) før starten av forsøket. Typiske parametere for høyfrekvent stimulering hos rotter er lik de som anvendes i klinisk human dyp hjernestimulering: frekvens på 130 to180 Hz, pulsbredde på 60 til 90 millisekunder, og strømamplitude på 100 til 250 uA 4,8-10. Merk: En lavere strøm brukes i gnager på grunn av sin reduserte størrelse sammenliknet med primat. 7. dyp hjernestimulering Prosedyre For å laste rotter i boksene, feste rustfritt stål våren kabel fra kommutatoren til hver elektrode pidestall på hodet cap. Test impedansen til hver elektrode ved å kjøre 5 uA av strøm ved en frekvensfra 1000 Hz for 2 sek. Hvis impedansen er lik eller mindre enn 125 Kohm, og deretter fortsette med eksperimentet fordi elektroden er i stand til å levere terapeutiske stimulering. Hvis impedansen er større enn 125 Kohm, vurdere å fjerne dyret fra eksperiment, fordi elektrodens høye motstand kan kutte strømmen til potensielt sub-terapeutiske nivåer. Kjør rottene gjennom en eller to mock økter for tilvenning der de vil bli festet til elektrodekabelen (e), men mottar ikke aktiv terapi. Mock testing vil eliminere eventuelle uspesifikke atferdsmessige effekter. Umiddelbart etter hvert mock session, transportere rottene til operant bokser for den daglige 2-timers økt av IV metamfetamin selvadministrering. Counter-balanse rotter inn i to grupper, en aktiv stimulering og humbug-stimulering kohort slik at baseline inntak er ikke signifikant forskjellig mellom gruppene. Utføre daglig DBS sesjons på gnager-kohorten for 5 dager i løpet som mottar de enten aktiv elektrisk hjernestimulering eller ingen stimulering i 3 timer avhengig av gruppeoppgave. Umiddelbart etter hvert DBS økt, transport rotter til de operante bokser for den daglige 2-timers økt av IV metamfetamin selvadministrering. Observere dyrene nøye under minst en del av hver DBS økt for å sørge for at stimulering er ikke forårsaker tydelige endringer i dyrenes atferd. Hvis noen unormal atferd oppstå under / etter stimulering, ta vare å dokumentere disse observasjonene. Merk: Forfatterne har ikke lagt merke til betydelige atferdsendringer eller endringer i mat / vanninntaket i løpet av eksperimentet beskrevet i denne artikkelen. Forandre lengden av DBS behandling, de elektriske parametere, og tiden mellom DBS sesjonen og sesjonen operant etter behov, avhengig av hypotesen.