Gjentatte Blodprøvetaking for blodprøver Adult Sebrafisk
Summary
Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.
Abstract
Gjentatte blodprøvetaking er en av de mest vanlige teknikker utført på forsøksdyr. Men ikke har blitt etablert et ikke-dødelig protokoll for blodprøvetaking fra sebrafisk. De tidligere metoder for blodprøvetaking fra sebrafisk er dødelige, for eksempel lateral snitt, halshogging og hale ablasjon. Dermed har vi utviklet en roman "gjentatt" blodinnsamlingsmetode, og presenterer her en detaljert protokoll som beskriver denne prosedyren. Denne metoden er minimal invasiv og resulterer i en meget lav dødelighet (2,3%) for sebrafisk, og dermed muliggjør gjentatte blodprøver fra samme individ. Det maksimale volum av blodprøver er avhengig av kroppsvekten av fisken. Volumet for gjentatte blodprøver med jevne mellomrom bør være ≤0.4% av kroppsvekt hver uke eller ≤1% hver 2 uker, noe som ble bedømt ved måling av blodhemoglobin. I tillegg hemoglobin, fastende blodsukker, plasma triacylglyserol (TG) og total cholesterol nivåer i mannlige og kvinnelige voksne sebrafisk ble målt. Vi har også brukt denne metoden for å undersøke feilregulering av glukosemetabolismen i kosten-indusert fedme. Denne blodprøvetaking metoden vil tillate mange programmer, inkludert glukose og lipid metabolisme og hematologiske studier, noe som vil øke bruken av sebrafisk som menneske sykdom modellorganisme.
Introduction
Sebrafisk er stadig økende popularitet som en verdifull modell av menneskelige sykdommer fordi deres organer og genetikk er lik de menneskene 1,2. I feltet av utviklingsbiologi, har mange studier vist at sebrafisk og menneske viser markerte likhet i hematopoiesen 3, hemostase 4,5, og myelopoiesis 6. Voksen sebrafisk er også brukt for å studere immunologiske 7, nevrodegenerativ 8 og fedmerelaterte sykdommer 9 fordi denne modellen organisme aksjer felles trasé med de forstyrret i menneskelige sykdommer. For fedme og fedmerelaterte sykdommer (diabetes, leversteatose og alkoholisk steatohepatitis og aterosklerose), sebrafisk blodsukker og lipider nivåer har blitt grundig undersøkt i flere transgene og diett-indusert fedme modeller 10-13.
Gjentatte blodprøvetaking fra individuelle dyr vil redusere bruk av dyr og fellrease inter forskjeller. Imidlertid er gjentatt prøvetaking teknisk vanskelig på små dyr som sebrafisk på grunn av deres forholdsvis små blodvolum og mangel på lett tilgjengelige fartøy. Flere metoder for engangs blodprøvetaking fra sebrafisk har blitt utviklet, selv om disse metodene har sine egne ulemper, inkludert dødelighet, tilhørende skade vev og begrenset blodvolum. For eksempel, kan 1-5 ul blod høstes fra en lateral snitt på omtrent 0,3 cm i lengde i området for den dorsale aorta 5. Halshogging med saks ved å kutte gjennom brystbelte kan samle 5-10 mL blod 10. En annen praktisk blodprøvetaking metoden er halen ablasjon 14. Hjertepunktering er en potensielt alternativ metode for gjentatte blodprøvetaking fra samme fisk, men svært liten mengde oppnådd (ca. 50 nl) med denne fremgangsmåten begrenser antallet av analyser som kan være utføMED 11. Følgelig er en ny protokoll for å muliggjøre gjentatt ikke-dødelige blodprøver, noe som ville være en kritisk tid som er nødvendig for denne organisme være en standard modellorganisme for humane sykdommer. Denne teknikk ville tillate testing av farmakologisk respons, oppdagelse av molekylære biomarkører for diagnostisering, bestemmelse av prognose og overvåking av forskjellige sykdommer, slik som metabolske sykdommer, degenerative sykdommer og en rekke forskjellige maligniteter.
Vi har derfor utviklet en minimal invasiv metode for å skaffe blod fra sebrafisk serielt 15. Her viser vi til prosedyren visuelt og gi en detaljert protokoll for denne teknikken. Ved hjelp av denne metoden, ble det normal verdi basert på ulike parametre, blant annet hemoglobin, fastende blodsukker, og lipider i blodet hos friske voksne sebrafisk evaluert. I tillegg har vi også vurdert om denne metoden er egnet for studier som krever serieprøver av monitoring tidsmessige endringer i blodglukosenivåer under overfôring eksperimenter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenterer her en detaljert protokoll for serielt skaffe blod fra voksen sebrafisk. Denne fremgangsmåten er enkel å utføre, og vi bruker den i laboratoriet på en daglig basis. Denne blodprøvetaking metoden er basert på å sette inn en glasskapillær nål inn i sebrafisk er rygg aorta. Under denne prosedyren, er det avgjørende å være forsiktig med å ikke ablate ryggraden fordi det er kriteriet for å søke etter rygg aorta. Redusere ryggraden skade vil forbedre overlevelse. Selv om denne teknikken er enkel …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 and 25590073. We would like to thank Ms. Yui Namie for the hand-drawn illustration, and Mr. Koshi Kataoka and Ms. Sayuri Ichikawa for assistance with the zebrafish maintenance.
Materials
| Glass capillaries with filament | Narishige | GD-1 | 1.0-mm-outer-diameter. |
| Needle puller | Narishige | PC-10 | To produce the needls |
| Heparin | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | For heparinization |
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | For blood collection |
| Bulb dispenser | Drummond | 1-000-9000 | For blood collection |
| 2-phenoxyethanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | For anesthetizing the fish |
| DRI-CHEM3500V | Fujifilm | – | For hemoglobin measurement |
| DRI-CHEM Slides | Fujifilm | Hb-WII | For hemoglobin measurement |
| Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho | – | For bood glucose measurement |
| Wako L-type TG kit | Wako Pure Chemical Industries | 464-44201 | For TG measurement |
| Wako L-type CHO kit | Wako Pure Chemical Industries | 460-44301 | For total cholesterol measurement |
| Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | To expel the blood on |
References
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Penberthy, W. T., Shafizadeh, E., Lin, S. The zebrafish as a model for human disease. Front Biosci. 7, d1439-d1453 (2002).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 101, 75-110 (2011).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 239-249 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br J Haematol. 107 (4), 731-738 (1999).
- Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult. Blood. 98 (10), 3087-3096 (2001).
- Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Exp Hematol. 42 (8), 697-706 (2014).
- Babin, P. J., Goizet, C., Raldua, D. Zebrafish models of human motor neuron diseases: advantages and limitations. Prog Neurobiol. 118, 36-58 (2014).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Dis Mod Mech. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
- Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10 (21), (2010).
- Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), e36474 (2012).
- Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquat Toxicol. 105 (1-2), 107-118 (2011).
- Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel, reliable method for repeated blood collection from aquarium fish. Zebrafish. 10 (3), 425-432 (2013).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods Mol Biol. 546, 45-65 (2009).
- Thorson, T. B. The partitioning of body water in Osteichthyes: phylogenetic and ecological implications in aquatic vertebrates. Biol Bull-US. 120, 238-254 (1961).
- Conte, F. P., Wagner, H. H., Harris, T. O. Measurement of blood volume in the fish (Salmo gairdneri gairdneri). Am J Physiol. 205, 533-540 (1963).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
- Nahas, K., Provost, J. -. P., Baneux, P. H., Rabemampianina, Y. Effects of acute blood removal via the sublingual vein on haematological and clinical parameters in Sprague-Dawley rats. Lab Anim. 34 (4), 362-371 (2000).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. DevDyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Andersson, O., et al. Adenosine signaling promotes regeneration of pancreatic beta cells in vivo. Cell Metab. 15 (6), 885-894 (2012).
- Hiramitsu, M., et al. Eriocitrin ameliorates diet-induced hepatic steatosis with activation of mitochondrial biogenesis. Sci Rep-UK. 4, 3708 (2014).
- Zang, L., Shimada, Y., Kawajiri, J., Tanaka, T., Nishimura, N. Effects of Yuzu (Citrus junos Siebold ex Tanaka) peel on the diet-induced obesity in a zebrafish model. J Funct Foods. 10, 499-510 (2014).
- Schlegel, A. Studying non-alcoholic fatty liver disease with zebrafish: a confluence of optics, genetics, and physiology. Cell Mol Life Sci. 69 (23), 3953-3961 (2012).
- Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
- Thomas, C. D., et al. Nutrient balance and energy expenditure during ad libitum feeding of high-fat and high-carbohydrate diets in humans. Am J Clin Nutr. 55 (5), 934-942 (1992).
