निष्प्राण मानव डर्मिस का प्रयोग आनुवंशिक रूप से संशोधित Organotypic त्वचा संस्कृतियों की पीढ़ी

Summary

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Abstract

Organotypic संस्कृतियों समारोह और उनके vivo ऊतक समकक्षों के शरीर क्रिया विज्ञान mimics जो सेल सेल से संपर्क करें और सेल-मैट्रिक्स बातचीत के लिए महत्वपूर्ण एक 3 डी वातावरण के पुनर्गठन की अनुमति देते हैं। यह ईमानदारी से एपिडर्मल भेदभाव और स्तरीकरण कार्यक्रम का स्मरण दिलाता है जो organotypic त्वचा संस्कृतियों द्वारा उदाहरण है। प्राथमिक मानव एपिडर्मल केरेटिनकोशिकाओं जीन आसानी overexpressed या नीचे गिरा दिया जा सकता है जहां रेट्रोवायरस के माध्यम से आनुवंशिक रूप से manipulable हैं। ये आनुवंशिक रूप से संशोधित केरेटिनकोशिकाओं तो आनुवंशिक रास्ते प्रभावित epidermal वृद्धि, भेदभाव, और रोग प्रगति का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल उपलब्ध कराने organotypic त्वचा संस्कृतियों में मानव एपिडर्मिस को पुनर्जीवित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल निष्प्राण मानव डर्मिस तैयार के रूप में अच्छी तरह से करने के लिए आनुवंशिक रूप से organotypic त्वचा संस्कृतियों उत्पन्न करने के क्रम में प्राथमिक मानव केरेटिनकोशिकाओं में हेरफेर करने की विधियों का वर्णन। पुनर्जीवित मानव त्वचा downstr में इस्तेमाल किया जा सकताइस तरह के जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा, immunostaining, और उच्च throughput अनुक्रमण के द्वारा पीछा क्रोमेटिन immunoprecipitations के रूप में विदेश मंत्री अनुप्रयोगों। इस प्रकार, इन आनुवंशिक रूप से संशोधित organotypic त्वचा संस्कृतियों की पीढ़ी त्वचा homeostasis को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि जीन के निर्धारण के लिए अनुमति देगा।

Introduction

मानव एपिडर्मिस ही नहीं बल्कि रक्षा के लिए रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में नमी की हानि को रोकने के लिए एक अभेद्य अवरोध के रूप में कार्य करता है तहखाने झिल्ली zone.The एपिडर्मिस के रूप में जाना जाता है एक बाह्य मैट्रिक्स के माध्यम से अंतर्निहित डर्मिस को जोड़ता है कि एक स्तरीकृत उपकला है विदेशी और विषाक्त पदार्थों को ¹ से शरीर। एपिडर्मिस की गहरी परत है जो बेसल परत, एपिडर्मिस ² के बाकी है कि फार्म विभेदित संतान को जन्म दे कि एपिडर्मल स्टेम और पूर्वज सेल शामिल हैं। एपिडर्मल पूर्वज कोशिकाओं को अलग रूप में वे spinous परत ³ के रूप में जाना जाता है विभेदित कोशिकाओं की पहली परत के रूप में ऊपर की तरफ पलायन। Spinous परत में, कोशिकाओं तो एपिडर्मिस की विभेदित परतों के लिए शारीरिक तनाव को झेलने की शक्ति प्रदान करते हैं, जो keratins 1 और 10 की अभिव्यक्ति, पर बारी। Spinous परत की कोशिकाओं को आगे अंतर के रूप में, वे करने के लिए एपिडर्मिस में ऊपर की तरफ कदमप्लाज्मा झिल्ली के नीचे इकट्ठा कर रहे हैं कि keratohyalin और परतदार कणिकाओं के गठन के साथ ही संरचनात्मक प्रोटीन द्वारा होती है जो बारीक परत हूँ। कोशिकाओं भेदभाव प्रक्रिया में आगे बढ़ने के रूप में परतदार कणिकाओं अमीर बाधा परत corneum ⁴ नामक एक लिपिड फार्म के लिए कोशिकाओं से चली जाती हैं, जबकि प्लाज्मा झिल्ली के नीचे प्रोटीन एक दूसरे से जुड़े पार कर रहे हैं।

Epidermal वृद्धि और भेदभाव प्रभाव ~ जनसंख्या ⁵ के 20% में परिवर्तन शामिल है कि रोग। इस प्रकार, इस प्रक्रिया के तंत्र को समझने के लिए काफी महत्व की है। इन रोगों के कई की अभिव्यक्ति सेल सेल या सेल मैट्रिक्स संपर्क पर प्रासंगिक है के बाद से, मानव एपिडर्मिस एक 3 डी वातावरण में पुनर्गठन किया गया है जहां organotypic संस्कृतियों ^6-10 बनाया गया है। इन तरीकों में आम तौर पर इस तरह के निष्प्राण मानव के रूप में बाह्य मैट्रिक्स पर वरीयता प्राप्त प्राथमिक या बदल केरेटिनकोशिकाओं के इस्तेमाल को शामिलडर्मिस, Matrigel, या कोलेजन।

Epidermal वृद्धि और भेदभाव में महत्वपूर्ण हैं कि जीन विनियामक तंत्र को समझने के लिए, केरेटिनकोशिकाओं आनुवंशिक रूप से 2 डी संस्कृति में जीन पछाड़ना या overexpress रेट्रोवायरल वाहक के माध्यम से छेड़छाड़ और उसके बाद 3 डी में पुनर्गठित किया जा सकता है। इन तरीकों में रसौली ^11-21 को एपिडर्मल स्टेम और पूर्वज सेल आत्म नवीकरण और भेदभाव के साथ ही प्रगति में शामिल जीनों को चिह्नित करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है। इधर, रेट्रोवायरस के प्रयोग के माध्यम एपिडर्मल organotypic संस्कृतियों में जीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन करने के बारे में एक में गहराई से प्रोटोकॉल प्रदान की जाती है।

Protocol

मानव त्वचा प्रोटोकॉल कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सैन डिएगो के रिसर्च आचार समिति के दिशा-निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया था। मानव त्वचा से खारिज शल्य नमूनों से प्राप्त या (त्वचा बैंक साम…

Representative Results

organotypic मानव त्वचा को पैदा करने में पहला कदम डर्मिस से एपिडर्मिस को दूर करने के लिए है। 37 डिग्री सेल्सियस 4x में कलम / स्ट्रेप / पीबीएस पर त्वचा के दो सप्ताह ऊष्मायन एपिडर्मिस (चित्रा 1 ए) से डर्मिस की जुद…

Discussion

Organotypic संस्कृतियों कई लाभ प्रदान करते मानव त्वचा में आनुवंशिक हेरफेर सामान्यतः 2 डी संवर्धित कोशिकाओं के साथ ही माउस मॉडल का अध्ययन करने के लिए। 2 डी संस्कृतियों बरकरार ऊतकों और अंगों में पाया तीन आयामी ?…

Materials

Human skin	New York Firefighters Skin Bank	http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html
PEN/STREP	GIBCO	15140-122
amphotropic phoenix cell lines	ATCC	CRL-3213
FUGENE 6 transfection reagent	Promega	E2691
Keratinocyte Media (KCSFM)	Life Technologies	17005042
DMEM	GIBCO	11995
Ham's F12	Cambrex	12-615F
FBS	GIBCO	10437-028
Adenine	Sigma	A-9795
Cholera Toxin	Sigma	C-8052
Hydrocortisone	Calbiochem	3896
Insulin	Sigma	I-1882
EGF	Invitrogen	13247-051
Transferrin	Sigma	T-0665
Ciprofloxacin Hydrochloride	Serologicals	89-001-1
cautery	Bovie Medical Corporation	AA01
Matrigel	Corning	354234
Keratin 1 antibody	Biolegend	PRB-149P
square pegs	Arts and crafts stores
human neonatal keratinocytes	ATCC	PCS-200-010
human neonatal keratinocytes	Cell Applications	102K-05n
MSCV retroviral vector	Clontech	634401
LZRS retroviral vector	Addgene
pSuper.Retro.Puro Retroviral vector	Oligoengine	VEC-PRT-0002
hexadimethrine bromide	Sigma	H9268-5G