Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organot�icas Usando desvitalizado derme humana

Summary

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Abstract

Culturas organotípicas permitir a reconstituição de um ambiente 3D crítica para interacções de contacto célula-célula e célula-matriz que imita a fisiologia e função dos seus homólogos de tecido in vivo. Isto é exemplificado por culturas de pele organot�icas que recapitula fielmente a diferenciação epidérmica e programa de estratificação. Queratinócitos epidérmicos humanos primários são geneticamente manipuláveis ​​através de retrovírus onde os genes podem ser facilmente sobre-expressos ou derrubado. Estes queratinócitos geneticamente modificados podem então ser usadas para regenerar epiderme humana em culturas organotípicas de pele proporcionando um poderoso modelo para estudar vias genéticas crescimento epidérmico de impacto, a diferenciação e a progressão da doença. Os protocolos aqui apresentados descrevem métodos para preparar derme humana desvitalizados, bem como manipular geneticamente queratinócitos humanos primários, a fim de gerar culturas organotípicas de pele. Pele humana regenerado pode ser usado em downstream aplicações, tais como perfil de expressão gênica, immunostaining, e imunoprecipitações cromatina seguido de seqüenciamento de alta taxa de transferência. Assim, a geração destas culturas organotípicas de pele geneticamente modificados permite a determinação dos genes que são essenciais para a manutenção da homeostase da pele.

Introduction

A epiderme humana é um epitélio estratificado que se conecta à derme subjacente através de uma matriz extracelular conhecida como a epiderme zone.The membrana basal não somente serve como uma barreira impermeável para impedir a perda de humidade, mas também como uma primeira linha de defesa para proteger o corpo de substâncias estranhas e tóxicas ^1. A camada basal, que é a camada mais profunda da epiderme, contém as células estaminais e progenitoras da epiderme que dão origem a progenia diferenciada para que formam o resto da epiderme ^2. Como as células progenitoras diferenciam epidérmicas que migram para cima para formar a primeira camada de células diferenciadas conhecidos como a camada espinhosa ^3. Na camada espinhosa, as células ligar a expressão de queratinas 1 e 10, que, em seguida, fornecer a força necessária para suportar o esforço físico para as camadas diferenciadas da epiderme. À medida que as células da camada espinhosa diferenciar ainda mais, que se movem para cima na epiderme para am a camada granular, que é caracterizada pela formação de querato-hialina e grânulos lamelares, bem como proteínas estruturais que são montados por baixo da membrana de plasma. Como as células em prosseguir o processo de diferenciação, as proteínas abaixo da membrana plasmática estão transversal ligados uns aos outros, enquanto os grânulos lamelares são extrudadas a partir das células de modo a formar uma barreira de lípidos ricos chamada estrato córneo ^4.

As doenças que envolvem alterações no crescimento epidérmico e impacto diferenciação ~ 20% da população ^5. Assim, o entendimento dos mecanismos deste processo é de grande importância. Desde manifestação de muitas destas doenças é contingente após a célula-célula ou célula-matriz de contacto, as culturas organotípicas de onde a epiderme humana é reconstituída num ambiente 3D foram criadas ^6-10. Estes métodos envolvem tipicamente a utilização de queratinócitos primários ou transformadas semeadas em matriz extracelular, tais como humano desvitalizadoderme, Matrigel, ou colagénio.

Para compreender os mecanismos regulatórios dos genes que são importantes no crescimento e na diferenciação da epiderme, os queratinócitos podem ser geneticamente manipulados através de vectores retrovirais para knockdown ou sobre-expressar genes em cultura e em seguida reconstituída 2D em 3D. Estes métodos têm sido amplamente utilizados para caracterizar genes envolvidos na haste epidérmica de células progenitoras e de auto-renovação e diferenciação, bem como a progressão para neoplasia ^11-21. Aqui, um protocolo em profundidade sobre como alterar a expressão genética em culturas organotípicas epidérmicas através da utilização de retrovírus é fornecido.

Protocol

O protocolo de pele humana foi realizada em conformidade com as diretrizes da Universidade da Califórnia, o Comitê de Ética em Pesquisa do San Diego. A pele humana pode ser obtido a partir de amostras cirúrgicas descartados ou comprados a partir de bancos de pele (pele banco está listado na Tabela de Materiais / Equipamentos). A localização, onde a pele é derivado a partir de ou a idade do dador não é crítica para a experiência, enquanto as proteínas da membrana basal (zona de colagénio / …

Representative Results

O primeiro passo na geração de pele humana organotípica é remover a epiderme da derme. A incubação de duas semana da pele a 37 ° C em 4x Pen / Strep / PBS deve permitir a separação da derme da epiderme (Figura 1A). Se a separação da epiderme e da derme, em seguida, é difícil colocar o tecido a 37 ° C em 4x Pen / Strep / PBS durante uma semana e, em seguida, tente novamente casca utilizando fórceps. Uma das chaves para a regeneração da epiderme humana na derm…

Discussion

A manipulação genética na pele humana culturas organotípicas oferecem muitas vantagens para comumente estudada 2D células cultivadas, bem como modelos de mouse. Culturas 2D faltam os três célula-célula e célula-matriz extracelular interacções dimensionais encontradas em tecidos e órgãos intactos. Estudos recentes também têm encontrado enormes diferenças entre as células de câncer de pele cultivadas em 2D e 3D com as células cultivadas em 3D que mostram muito mais semelhanças de expressão do gene par…

Materials

Human skin	New York Firefighters Skin Bank	http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html
PEN/STREP	GIBCO	15140-122
amphotropic phoenix cell lines	ATCC	CRL-3213
FUGENE 6 transfection reagent	Promega	E2691
Keratinocyte Media (KCSFM)	Life Technologies	17005042
DMEM	GIBCO	11995
Ham's F12	Cambrex	12-615F
FBS	GIBCO	10437-028
Adenine	Sigma	A-9795
Cholera Toxin	Sigma	C-8052
Hydrocortisone	Calbiochem	3896
Insulin	Sigma	I-1882
EGF	Invitrogen	13247-051
Transferrin	Sigma	T-0665
Ciprofloxacin Hydrochloride	Serologicals	89-001-1
cautery	Bovie Medical Corporation	AA01
Matrigel	Corning	354234
Keratin 1 antibody	Biolegend	PRB-149P
square pegs	Arts and crafts stores
human neonatal keratinocytes	ATCC	PCS-200-010
human neonatal keratinocytes	Cell Applications	102K-05n
MSCV retroviral vector	Clontech	634401
LZRS retroviral vector	Addgene
pSuper.Retro.Puro Retroviral vector	Oligoengine	VEC-PRT-0002
hexadimethrine bromide	Sigma	H9268-5G