This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.
其中最刺激的观察在植物进化是地磁场的发生(GMF)逆转(或偏移)和被子植物的辐射的瞬时之间的相关性。这导致了在基因改造食品极性的改变可能在植物进化中起作用的假说。在这里,我们描述了一个方法,通过使拟南芥人为地逆转GMF条件下检验这一假设。我们使用了三轴磁力计和收集到的数据被用于计算该转基因食品的大小。三个DC电源被连接到三个亥姆霍兹线圈对以及由计算机得到控制,以改变GMF条件。在培养皿中生长的植物被暴露在正常和反向的基因改造食品的条件。还进行深水暴露实验。在实验过程中暴露的植物进行拍照和图像进行分析,以计算根长和叶面积。拟南芥提取总RNA和定量分析在十字花科3(CRU3),铜转运蛋白1(COTP1),氧化还原响应转录因子1(RRTF1),铁超氧化物歧化酶1,(FSD1),Catalase3(CAT3),Thylakoidal的基因表达进行实时PCR(qPCR的) 抗坏血酸过氧化物酶(TAPX),胞质抗坏血酸Peroxidase1(APX1),和 NADPH /呼吸爆发氧化酶蛋白D(RbohD)。四个不同的参考基因进行分析,以归一化的qPCR结果。的四个基因最好选择和使用了最稳定的基因进行标准化。我们的数据显示,在第一次,使用三轴线圈扭转GMF极性具有对植物生长和基因表达显著影响。这支持了GMF反转有助于诱导的变化在植物发育的假设,可能证明较高的选择压力,最终导致为p兰特演变。
地球的磁场(或等价地磁场,GMF)是所有生活在地球上的生物,包括植物一个无法回避的环境因素。在转基因食品一直是地球的自然功能,因此在进化过程中,所有生物经历了行动。越来越多的证据体表明GMF是能够影响许多生物过程1。该基因改造食品是不均匀的并且有在地球的表面上在它的大小和方向显著地方的差异。在转基因食品在地球表面显示了广泛的幅度,从不到30μT几乎70μT。该转基因食品通过磁层2偏转大部分带电粒子保护地球及其生物圈来自太阳风的致命影响。
植物对环境刺激作出反应;和古典响应非生物因素如光和重力已经吨通过定义所谓的向光性和向地响应horoughly说明。很少或没有,被称为悟性和植物磁场反应的机制,尽管发表了关于这个话题,最近回顾1篇论文多如牛毛。不同的是引力场,在转基因食品植物进化过程中始终如一地改变,从而表示最近已被认为是潜在的动力,最终促进植物多样性和物种2重要的非生物胁迫因素。地磁反转(或偏移)的变化,转基因食品的极性。在地球的生命史,转基因食品的逆转发生几次。这些每一个极性转换过程中暴露出来的星球降低GMF实力周期。一些作者已经推测的低强度GMF这些过渡期间可能已经允许电离辐射从太阳风到达地球表面,从而诱导一一贯强调要活的生物体,这本来是强大到足以引起基因的改变最终导致植物进化2。
实验说明磁场对植物的影响进行详细的分析表明,大量的矛盾的报告,其特点是似是而非的生物物理相互作用机制的缺乏。许多实验都根本不现实,而另一些人缺乏检验的假设,最终都难以令人信服3。在过去几年中,在植物磁场的影响的进展和研究现状进行了审查2,4-11。近日,低和高磁场的影响进行了深入的讨论1,特别侧重于基因食品逆转事件的植物进化2的参与。
最直接的手段来证实这一假设转基因食品的逆转影响植物的进化是合成一种转基因食品逆转在实验室中通过检测植物对正常和反向的磁场条件下的反应。为了检验这一假设,我们因此建立了一个三轴亥姆霍兹八角线圈对磁场的补偿系统(三轴线圈),其能够准确地扭转正常GMF条件。
我们用拟南芥为模式植物,我们测试了逆转基因食品对一些重要基因的基因表达的影响: 十字花科3(CRU3),其编码12S种子贮藏蛋白,这种蛋白酪氨酸磷酸化和磷酸化状态被调制响应对ABA在拟南芥种子12,13; 铜运输蛋白1(COTP1),编码重金属运输/解毒家族蛋白在土壤中铜的采集和花粉发育14的主要功能;和氧化还原响应转录因子1(RRTF1)编码该ERF(乙烯反应因子)亚家族B-3的ERF / AP2转录因子家族,其中包含一个AP2结构域促进协同共激活的基因表达的途径和赋予交叉耐受性的非生物和生物胁迫15中的一员。
此外,我们还分析了五个基因参与氧化应激反应: 铁超Dismutase1,(FSD1),编码胞质酶酶促并迅速转换超氧阴离子(O 2 – )和水 (H 2 O)与过氧化氢 (H 2 O 2)和分子氧(O 2),16; Catalase3(CAT3),即编码和酶,其催化的H击穿2 O 2成水和氧17,18; Thylakoidal抗坏血酸过氧化物酶(TAPX),其编码叶绿体类囊体过氧化物酶能清除H 2 O的2 19; 抗坏血酸Peroxidase1(APX1),其编码胞质过氧化物能清除H 2 O的2和表示由NO-衍生分子20介导的翻译后修饰的潜在目标之一;和NADPH- 呼吸爆发氧化酶蛋白D(RbohD)编码生成O 2的酶–和调节生长,发育和应激反应在拟南芥21起着举足轻重的作用。
我们的现场逆转方法提供了第一手的证据表明转基因食品反转可诱导A的形态学和基因表达显著的变化拟南芥根与芽。这个协议提供了一种创新的方法来评估基因食品逆转对植物形态和基因表达的效果,并且可以用来评估GMF逆转对植物的行为的其他方面的潜在影响,并从而引导ロ讨论乐反转基因食品对植物进化的。
我们最近发现,转基因食品的逆转,当大多数家族被子植物谱系转移发生2时之间存在惊人的相关性。然而,尽管刺激假设和研究上的变化的基因改造食品强度效果的过多,假设GMF逆转自身可诱导在植物基因表达和形态学显著变化从未被证实。这里,我们表明,第一次,使用三轴八角亥姆霍兹线圈扭转GMF在我们的实验室,并且环境磁场的反转会导致表型变化和基因表达的植物中调制的方法。
为了获得GMF反转(或修改)在足够体积的植物生长试验(2×2×2米3),我们建立了一个八角亥姆霍兹线圈系统。该系统是不可商购(通常亥姆霍兹线圈环形和更小)和建设的费用是相当大的。重要的是,该系统提供了强大的现场修改,具有优异的时间稳定性和均匀性在修改后的磁场。
该系统的设计和建造,以减少GMF的值的正常条件千分之一或扭转任何磁场的三个方面的。然而,线圈的设计不允许以产生高磁场强度。因此,该仪器在本形式不适合用来评估的高磁场强度对植物或其它生物的影响的实验。
在实验室中,改变的GMF类似于在此方法中所描述的已用不同的方法获得,包括屏蔽由铁磁金属板具有高导磁率,其中偏离磁场和金属本身内集中他们周围的实验区。钍Ë优点使用亥姆霍兹线圈的是,该系统允许植物暴露于更多的自然条件下(光,空气流通等 ),从而使其不仅适合在体外研究 (与使用的培养皿),但也用于体内植物生长和发育的实验。我们的系统的尺寸创造一个空间,它允许抑制到天然基因食品<1 / 1,000整个25×25×25厘米3的球形体积( 见图 1A),从而使托管多个佩特里细菌培养皿或一些小盆植物生长。
这里介绍的方法已被应用到植物生物学研究;然而,该系统允许大范围的实验,包括病毒学,微生物学,以及对线虫(例如, 秀丽隐杆线虫 ),节肢动物和小动物(包括小鼠和大鼠)的研究。因此,在假设的测试,反转基因食品能以诱导形态学和转录变化也可以扩大到许多其他生命系统,可能最终甚至到人细胞。
该转基因食品是不断变化和波动。因此,在我们的实验中的一个主要挑战是提供基因改造食品的一个常数补偿,以获得所需的新基因改造食品的值。通过磁场值的连续控制,通过读取磁强计值和电压补偿时才可以实现。因此,该系统可以补偿基因改造食品的缓慢变化的一部分,但它不执行任何对于较高频率的波动。
总之,利用三轴线圈扭转GMF矢量是有助的,以证明这种逆转的GMF的载体是能够诱导植物的形态变化和差别基因表达。用该方法获得的结果提供了令人信服的证据支持的假设,即转基因食品重新versals可能是植物进化的驱动力之一在地质时间尺度2。
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant to MEM from the Dept. of Life Sciences and Systems Biology of the University of Turin, Italy. The authors thank G. Gnavi for technical assistance during some experiments. CTR is funded by the Wellcome Trust and the Royal Society (Grant Number 098436/Z/12/Z).
three-axis magnetometer | Bartington | Mag-03MC | triaxial fluxgate magnetometer |
Magnetometer power supply | Bartington | Mag-03PSU | triaxial fluxgate magnetometer |
Magnetometer software | Bartington | Mag03DAM | triaxial fluxgate magnetometer |
DC power supply | Agilent Technologies | E3642A | |
Calcium hypochlorite | Sigma | 211389 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Ethanol | Sigma | 2860 | |
GroLux Sodium vapor lamps | OSRAM Sylvania | 600W | |
RNeasy Plant RNA kit | Qiagen | 74903 | |
RNase-Free DNase | Qiagen | 79254 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific | not available | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
Mx3000P | Agilent Technologies | 401512 | |
2X MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix | Fermentas International, Inc | K0221 | |
Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
Petri dish square (120×120) | Sigma | Z692344 |