This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.
Einer der anregendsten Beobachtungen in der Pflanzenentwicklung eine Korrelation zwischen dem Auftreten des Erdmagnetfeldes (GMF) Auflösungen (oder Ausflüge) und dem Zeitpunkt der Strahlung der Angiospermen. Dies führte zu der Hypothese, dass Veränderungen im GMF Polarität kann eine Rolle bei der Pflanzenevolution spielen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um diese Hypothese durch Aussetzen Arabidopsis thaliana künstlich umgekehrt GMF Bedingungen zu testen. Wir verwendeten ein Drei-Achsen-Magnetometer und die gesammelten Daten wurden verwendet, um die Größe des GMF berechnen. Drei DC-Netzteile wurden zu drei Helmholtz-Spulenpaare verbunden und wurden von einem Computer gesteuert, um die GMF Bedingungen zu ändern. Pflanzen in Petrischalen gezüchtet wurden sowohl normale freigelegt und umgekehrt GMF Bedingungen. Schein-Expositions-Experimente wurden ebenfalls durchgeführt. Exposed Pflanzen wurden während des Experiments fotografiert und die Bilder wurden analysiert, um die Wurzellänge und Blattflächen zu berechnen. Arabidopsis Gesamt-RNA wurde extrahiert und QuantitativeEchtzeit-PCR (qPCR) Analysen wurden auf die Genexpression von Cruciferin 3 (CRU3), Kupfer Transport protein1 (COTP1), Redox gesteuerten Transkriptions Factor1 (RRTF1), Fe Superoxide Dismutase 1 (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal geführt Ascorbatperoxidase (TapX), einer zytosolischen Ascorbat Peroxidase1 (APX1) und NADPH / respiratory burst oxidase Protein D (RbohD). Vier verschiedene Referenzgene wurden analysiert, um die Ergebnisse der qPCR normalisieren. Die beste der vier Gene, wurde ausgewählt und die stabilste Gen zur Normalisierung verwendet. Unsere Daten zeigen zum ersten Mal, dass die Umkehrung der Polarität GMF mit dreiachsigen Spulen hat erhebliche Auswirkungen auf das Pflanzenwachstum und die Genexpression. Dies stützt die Hypothese, dass die GMF Umkehr trägt zu induzieren Veränderungen in der Pflanzenentwicklung, die einen höheren Selektionsdruck rechtfertigen könnten, was schließlich zu p führendenlant Evolution.
Das Magnetfeld der Erde (oder äquivalent das Erdmagnetfeld, GMF) ist eine unausweichliche Umweltfaktor für alle lebenden Organismen auf der Erde, einschließlich Pflanzen. Die GMF ist seit jeher eine natürliche Eigenschaft der Erde, so dass im Laufe der Evolution erlebten alle Lebewesen seine Wirkung. Liegen zunehmend Belege dafür, dass das GMF der Lage ist, viele biologische Prozesse 1 beeinflussen. GMF nicht einheitlich, und es gibt erhebliche lokale Unterschiede in der Größe und Richtung an der Oberfläche der Erde. Die GMF an der Erdoberfläche zeigt eine breite Palette von Größen, von weniger als 30 & mgr; T, um fast 70 & mgr; T. Die GMF schützt die Erde und ihrer Biosphäre von den tödlichen Auswirkungen der Sonnenwind durch Ablenken meisten seiner geladenen Teilchen durch die Magnetosphäre 2.
Pflanzen reagieren auf Reize aus der Umwelt; und der klassischen Reaktionen auf abiotische Faktoren wie Licht und Schwerkraft haben t gewesenhoroughly durch Definition der sogenannten phototropen und gravitrope Reaktionen beschrieben. Sehr wenig oder gar nichts tun, wird über die Mechanismen der Wahrnehmung und Reaktionen von Pflanzen gegenüber Magnetfeldern bekannt, trotz der Fülle von Arbeiten zu diesem Thema veröffentlicht und vor kurzem überprüft 1. Anders als das Gravitationsfeld, änderte sich die GMF konsequent während der Pflanzenentwicklung damit einen wichtigen abiotischen Stressfaktor, der vor kurzem als eine potenzielle Antriebskraft letztlich einen Beitrag zur Diversifizierung und Artbildung 2 pflanzen darstellt. Feldumkehrung (oder Ausflüge) sind Änderungen der Polarität des GMF. Während der Lebensgeschichte der Erde, GMF Wertaufholungen kam mehrmals. Diese freiliegenden den Planeten zu Zeiten der reduzierten GMF Festigkeit bei jedem Polaritätsübergang. Einige Autoren haben die Hypothese aufgestellt, dass diese Übergänge Zeiten geringer GMF Stärke könnte erlaubt haben, ionisierende Strahlung aus dem Sonnenwind auf der Oberfläche der Erde zu erreichen, wodurch eine Induktionkonsistente Belastung für lebende Organismen, die stark genug gewesen, um Gen-Veränderungen schließlich zu induzieren, die zu Evolution 2 pflanzen konnte.
Eine detaillierte Analyse der Experimente beschreiben die Wirkung von Magnetfeldern auf die Pflanzen eine große Anzahl von widersprüchliche Berichte, gekennzeichnet durch einen Mangel der plausiblen biophysikalischen Wirkungsmechanismen. Viele Experimente sind einfach unrealistisch, während andere fehlt eine testbare Hypothese, und letztlich nicht überzeugend 3. In den letzten Jahren hat sich der Fortschritt und Stand der Forschung über die Wirkung von Magnetfeldern auf die Anlage überprüft 2,4-11. Vor kurzem hat die Wirkung der beiden niedrigen und hohen Magnetfeld eingehend erörtert 1 wurde, mit einem besonderen Schwerpunkt auf der Beteiligung von GMF Umkehr Veranstaltungen an Pflanzenevolution 2.
Die direkte Methode, um die Hypothese zu untermauern, dass GMF Auflösungen beeinflussen Pflanzenevolution ist es, eine GMF synthetisierenUmkehr im Labor durch Testen der Reaktion von Pflanzen auf normale und umgekehrte Magnetfeldbedingungen. Um die Hypothese zu testen, daher haben wir eine achteckige dreiachsigen Helmholtzspule-Paaren Magnetfeld-Kompensationssystem (Drei-Achs-Spulen), die in der Lage, die normalen GMF Bedingungen genau umgekehrte ist.
Wir verwendeten Arabidopsis thaliana als Modellpflanze und wir die Wirkung rückgängig GMF auf die Genexpression einiger wichtiger Gene getestet: Cruciferin 3 (CRU3), die eine 12S Samenspeicherprotein, das tyrosinphosphorylierten ist und dessen Phosphorylierungszustand in Reaktion moduliert kodiert ABA in Arabidopsis thaliana Samen 12,13; Die Kupfer Transport protein1 (COTP1), die eine Schwermetalltransport / Entgiftung Super Protein mit der vorherrschenden Funktion im Boden Cu Erwerb und Pollenentwicklung 14 kodiert; und Redox-gesteuerten Transkriptions Factor1 (RRTF1)dass kodiert für ein Mitglied des ERF (Ethylen-Antwort-Faktor) Unterfamilie B-3 der EFF / AP2 Transkriptionsfaktor-Familie, die eine AP2-Domäne, die die synergistische Co-Aktivierung der Genexpression Wege sowie verleihen Quer Toleranz gegenüber abiotischen und biotischen betont 15 enthält.
Darüber hinaus haben wir auch analysiert fünf Gene in oxidativen Stress-Antworten beteiligt sind: Fe Superoxid Dismutase1 (FSD1), das ein zytoplasmatisches Enzym, das enzymatisch und schnell wandelt das Superoxidanion kodiert (O 2 -) und Wasser (H 2 O) zu Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) und molekularem Sauerstoff (O 2) 16; Catalase3 (CAT3), dass dieses Enzym codiert, und die den Abbau von H 2 O 2 in Wasser und Sauerstoff 17,18 katalysiert; Thylakoidal Ascorbatperoxidase (TapX), das ein kodiert Chloroplasten thylakoid Peroxidase, die H 2 O abfängt2 19; Ascorbate Peroxidase1 (APX1), das eine cytosolische Peroxidase umfaßt, die H 2 O 2 spült und stellt eines der möglichen Ziele von post-translationalen Modifikationen von NO-abgeleiteten Molekülen 20 vermittelte codiert; und NADPH Respiratory Burst-Oxidase Protein D (RbohD), die ein Enzym, das O 2 erzeugt codiert – und spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Wachstums, der Entwicklung und Stressantworten in Arabidopsis 21.
Unsere Feldumkehr Methode liefert den ersten Beweis, dass GMF Umkehr kann eine signifikante Veränderung in der Morphologie und Genexpression von A. induzieren thaliana Wurzeln und Sprossen. Dieses Protokoll stellt eine innovative Möglichkeit, die Wirkung von GMF Umkehr auf Pflanzenmorphologie und der Genexpression zu bewerten und kann verwendet werden, um die möglichen Auswirkungen der GMF Umkehr auf andere Aspekte der Anlagenverhalten zu bewerten und dadurch zu führen Diskussion der role der GMF Umkehr auf die Pflanzenentwicklung.
Wir haben kürzlich gezeigt, dass eine erstaunliche Korrelation zwischen GMF Wertaufholungen und der Zeit, als Abzweigung von den meisten der familiären Angiospermen Abstammungslinien aufgetreten 2 existiert. Doch trotz der stimulierenden Hypothesen und der Fülle von Studien über die Wirkung von verschiedenen GMF Intensitäten, die Annahme, dass GMF Umkehr kann selbst herbei signifikanten Veränderungen in Pflanzengenexpressions und Morphologie noch nie gezeigt worden. Hier zeigen wir zum ersten Mal ein Verfahren, das eine achteckige triaxial Helmholtz-Spule verwendet, um GMF in unserem Labor umzukehren, und daß die Umkehr der Umgebungsmagnetfeld phänotypischen Veränderungen und Modulation der Genexpression in Pflanzen verursachen.
Um GMF Umkehr (oder Änderung) über ein ausreichendes Volumen für die Pflanzenwachstumsexperimente (2 x 2 x 2 m 3) zu erhalten, bauten wir einen achteckigen Helmholtz-Spulensystem. Dieses System ist nicht im Handel erhältlich (üblicherweise Helmholtzspulen sind ringförmig und kleiner)und die Kosten für den Bau waren beträchtlich. Wichtig ist, liefert dieses System robuster Feldmodifikation, mit außergewöhnlichen Zeit-Stabilität und Homogenität in den modifizierten Magnetfeldern.
Das System ist so konzipiert und aufgebaut, um den Wert der GMF auf ein Tausendstel der normalen Bedingungen zu reduzieren oder um einen der drei Dimensionen des Magnetfeldes umzukehren. Allerdings ist der Entwurf der Spulen nicht erlauben, eine hohe magnetische Feldstärke zu erzeugen. Daher ist dieses Gerät in der vorliegenden Form nicht geeignet für Experimente entworfen, um die Wirkung der hohen magnetischen Feldstärke auf Pflanzen oder andere Organismen zu beurteilen.
Im Labor hat die Veränderung des GMF ähnlich den in diesem Verfahren beschrieben durch verschiedene Verfahren gewonnen wurde, auch Abschirmung durch Umgeben der Versuchszone durch ferromagnetische Metallplatten mit hoher magnetischer Permeabilität, die Magnetfeldern abweichen und konzentriert sie im Metall selbst. The Vorteil der Verwendung von Helmholtzspulen ist, dass das System ermöglicht Pflanzen möglichst natürlichen Zustand (Licht, Luftzirkulation, etc.) ausgesetzt werden, so dass es sich nicht nur für in-vitro-Studien (wie bei der Verwendung von Petrischalen), sondern auch zur in vivo-Pflanzenwachstum und -entwicklung Experimenten. Die Abmessungen der unser System zu schaffen einen Raum, der eine Unterdrückung bis <1 / 1.000 der natürlichen GMF ermöglicht über einen 25 x 25 x 25 cm 3 Kugelvolumen (siehe 1A), so dass mehrere Petrischalen oder eine kleine Gastgeber Töpfe für das Pflanzenwachstum.
Die hier vorgestellte Methode zur Pflanzenbiologie Studien angewandt wurden; jedoch kann das System eine Vielzahl von Experimenten, darunter Virologie und Mikrobiologie, sowie Studien über Nematoden (zB Caenorhabditis elegans), Arthropoden und kleine Tiere (einschließlich Mäusen und Ratten). Daher Tests der Hypothese, dass die Umkehrung der GMF ist in der Lagezur Induktion morphologischer und Transkriptionsänderungen können auch auf viele andere lebende Systeme erweitert werden, möglicherweise letztlich sogar auf menschliche Zellen.
Die GMF ändert sich ständig und schwankenden. Daher ist in unseren Experimenten eine große Herausforderung ist, eine konstante Vergütung des GMF, um die gewünschte neue GMF-Werte zu erhalten ist. Dies kann nur durch eine kontinuierliche Steuerung der Magnetfelder Werte durch Lesen des Magnetowerte und Spannungskompensation erreicht werden. Daher kann das System den langsam variierenden Teil des GMF zu kompensieren, aber es tut nichts zur höheren Frequenzschwankungen.
Zusammenfassend war die Verwendung von triaxialen Spulen um die GMF Vektorumkehr instrumental zu demonstrieren, dass diese Umkehrung des GMF-Vektor ist in der Lage, Pflanzen morphologische Veränderungen und differentielle Genexpression zu induzieren. Die mit dem vorgestellten Verfahren erzielten Ergebnisse bieten eine überzeugende Beweise für die Hypothese, dass die GMF WiederVersalien könnte eine der treibenden Kräfte für die Pflanzenentwicklung haben über geologische Zeitskalen 2.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant to MEM from the Dept. of Life Sciences and Systems Biology of the University of Turin, Italy. The authors thank G. Gnavi for technical assistance during some experiments. CTR is funded by the Wellcome Trust and the Royal Society (Grant Number 098436/Z/12/Z).
three-axis magnetometer | Bartington | Mag-03MC | triaxial fluxgate magnetometer |
Magnetometer power supply | Bartington | Mag-03PSU | triaxial fluxgate magnetometer |
Magnetometer software | Bartington | Mag03DAM | triaxial fluxgate magnetometer |
DC power supply | Agilent Technologies | E3642A | |
Calcium hypochlorite | Sigma | 211389 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Ethanol | Sigma | 2860 | |
GroLux Sodium vapor lamps | OSRAM Sylvania | 600W | |
RNeasy Plant RNA kit | Qiagen | 74903 | |
RNase-Free DNase | Qiagen | 79254 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific | not available | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
Mx3000P | Agilent Technologies | 401512 | |
2X MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix | Fermentas International, Inc | K0221 | |
Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
Petri dish square (120×120) | Sigma | Z692344 |