Эндотелиальных клеток Planar Модель для работы с изображениями иммунологии Synapse Dynamics

Summary

Adaptive immunity is controlled by dynamic ‘immunological synapses’ formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of ‘planar cellular APC model’.

Abstract

Адаптивного иммунитета регулируется динамического взаимодействия между Т-клетками и антиген-представляющих клеток ("БТР") называют «иммунологических синапсов». В этих интимных межклеточных интерфейсов дискретные суб-кластеры сотовой МНС / Ag-TCR, F-актина, адгезия и сигнальные молекулы образуют и быстро переделывать. Такая динамика, как считается, критические детерминанты как эффективность и качество иммунных ответов, которые развиваются, и поэтому защитных против патологического иммунитета. Современное понимание иммунологических синапсов с физиологической БТР ограничивается неадекватности получаемой разрешением изображения. Хотя искусственные модели подложки (например, плоские липидных бислоев) предлагают превосходное разрешение и чрезвычайно ценный инструмент, они по своей природе не физиологическая, а упрощенное. Сосудистые и лимфатические эндотелиальные клетки превратились в важную периферических тканей (или стромальных) отсеке "полу-профессииаль БТР. Эти бронетранспортеры (которые выражают большую часть молекулярных машин профессионального БТР) имеют уникальную особенность формирования практически плоскую поверхность клеток и легко transfectable (например, с флуоресцентным белком журналистами). В этом основной подход к осуществлению эндотелиальные клетки в качестве нового и физиологический "плоской модели сотовых APC 'для улучшения изображений и опроса основных антигенных обрабатывает сигнализацию будут описаны.

Introduction

Т-лимфоциты являются филиал адаптивной иммунной системы характеризуется способностью эффективно распознавать пептид антигена (АГ), связанного с главным комплексом гистосовместимости (МНС) молекул через их Т-клеточных рецепторов (TCR) ^1. Наивные лимфоциты мигрируют конструктивно и сканирования »профессиональные Ag представляющих клеток (АПК»; например, дендритные клетки) в лимфатических узлах, в то время как память / эффекторные Т-клетки должны эффективно обследовать чрезвычайно широкий спектр БТР и потенциальных целевых клеток в периферических тканях.

В следующем мин первоначального признания родственных Ag на БТР, лимфоциты арестовать их миграции и начинают формировать специализированные интимную интерфейс клетка-клетка называется "иммунологическое синапсов» (IS). Устойчивый (т.е. 30-60 мин) контакты должны усиливать и поддерживать сигнализации ^2-7. Новые исследования определить, что в есть, это непрерывное образование и быстрое гemodeling дискретных субклеточном сигнализации микро-кластеров (т.е., содержащих МНС / Ag-TCR, F-актин, адгезию и сигнальные молекулы), которые определяют силу и качество в результате иммунных ответов ^2-7. Тем не менее, динамические данные и механизм регулирования этого процесса полностью понял ^8,9. Это связано в основном с техническими проблемами, связанными с неправильной топологии поверхностей APC и плохо контролируемой ориентации плоскостей взаимодействия клетка-клетка, вопросов, которые глубоко ограничивают необходимую пространственно-временной обработки изображений подходов ^8-10 (Figure1A).

Рисунок 1. Физиологическая Planar сотовый APC Модель изображений иммунологии Synapse Dynamics. Схема иллюстрирует традиционный изображений иммунологической синапса между Т-клетки и профес NAL APC (А) и Т-клеток и традиционный плоский липидов модель бислой APC (В) по сравнению с этой новой модели эндотелиальной плоской APC (C). Профессиональные БТР обеспечить физиологические иммунологические синапсы, но предлагают мало ориентированный интерфейс клетка-клетка (т.е., по отношению к оптимальной плоскости изображения ху, разрешение ~ 0,2 мкм), что резко компрометирует пространственное (г визуализации самолет разрешения ~ 1 мкм) и временная (т.е. в связи с необходимостью многократно сканировать всех плоскостях изображений г) разрешение изображения. Двухслойные модели имеют плоскую топологию, что обеспечивает оптимальную пространственно-временной изображения разрешением, но также сильно упрощенной, не физиологические и жесткой. Это эндотелия модель сотового сочетает в себе плоскую топологию липидного бислоя с физиологической подложки классического APC, чтобы доставить оптимального пространственное и временное разрешение изображений в физиологическом обстановке.м / файлы / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Предыдущие исследования частично обойдена эти препятствия путем разработки моделей плоскую подложку (т.е. липидных бислоев и поверхностей покрытых антителами), которые обеспечивают оптимальную пространственно-временной разрешение (т.е. с помощью фиксации поверхность активации Т-клеток в единый план, параллельной оптимальной визуализации ху Плоскость) ^11-15 (Фигура 1В). Эти модели способствовали важные идеи в субклеточных / молекулярной динамики, которые контролируют антигенный сигнализации в Т-клетках, в том числе открытие динамического актина / TCR сигнализации микро-кластеров ^7,11-14. Тем не менее, такие модели изначально упрощать, а также жесткой (исключающее развитие / изучение 3-мерных топологических особенностей) (рис 1B). Таким образом, остается неясным, как связать такие выводы PHYsiologic клетка-клетка иммунный надзор.

Хотя до сих пор изучено недостаточно, сосудистой и лимфатические эндотелиальные клетки возникают, как большой (т.е. больше, чем в цифрах всех профессиональных БТР, на ~ 1000 раз) периферической отсеке "полу-профессиональной" БТР ^16-18. Эти клетки экспрессируют MHC-I-, MHC-II- и множество молекул со-стимуляторов (например, CD40, LFA3, ICOSL, 4-1ВВ, OX40L, TL1A, PD-L1, но не CD80 и CD86) и стратегически расположенный на границе кровь-ткань, где они служат специализированные функции дозорных ^16-18. Предыдущие исследования показали, что эндотелиальные клетки могут эффективно повторно стимулировать эффекторной / память, но не наивным, Т-клетки ^19-25. Таким образом, эндотелиальные клетки, вероятно, играют уникальную роль в эффекторной APC фазе адаптивных иммунных реакций в пределах периферических тканях, таких как локального воздействия на активацию Т-клеток, дифференцировки, памяти и толерантности ^16,17,26. Крически, при выращивании в пробирке, эндотелиальные клетки образуют практически плоские поверхности клеток и легко transfectable (например, с флуоресцентным белком журналистами). Эти особенности идеально подходят для высокой пространственно-временной разрешающей способностью топологических динамики при межклеточных взаимодействий ^19,27. Таким образом, эндотелиальные клетки может служить физиологический "плоской сотовой APC» модели отчетливо подходит для изучения субклеточных / молекулярные механизмы ремоделирования, которые управляют распознавания антигенов и регулируют ответов (рис 1в) ^19,20.

Ранее установлено, комплементарные методы визуализации (в том числе трансфекции эндотелии клеток с флуоресцентными производителей белка мембраны плазмы и цитозоле) для изучения деталей лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия при адгезии и трансэндотелиальной миграции ^27, показали, что лейкоциты активно зондировать поверхность эндотелии динамического вставкад втягивание субмикронных масштабах, актин-богатых цилиндрические выступы (~ 200-1000 нм в диаметре и глубиной) называется invadosome, как выступы (то есть, "ILPs ') ^27,28. Эти подходы изображений были расширены наряду с созданием протоколов, чтобы воспользоваться функцией эндотелия APC развивать первые методы пространственно-временной высокой разрешающей способностью в Т-клеток-эндотелиальной иммунологической синапса Как сообщалось ^19,20 и далее описанных здесь. Центральный вывод, производный от этого романа плоской модели APC сотовой том, что Т-клеточные ILPs функционировать как в поощрении начального обнаружения Ag и в поддержании последующее сигнализации. В самом деле, массивы нескольких ILPs (которые были стабилизированы и начисленных в ответ на начальный поток кальция) Показать обогащение TCR и молекул наводящий активного сигнального такой ПКС-Q, ZAP-70, фосфотирозина и HS1. Таким образом, ILPs-видимому, представляют собой трехмерную физиологическую эквивалентную ТКР сигнализации микрокластеры видели в плоских моделей двухслойных. Этот подход, таким образом, чутко показывает / отчеты молекулярные и архитектурные (и подразумеваемые биомеханические) динамика не иначе обнаруживается.

Метод, описанный в данном документе должны быть полезными для преодоления разрыва между профессиональной APC и искусственных моделей APC субстрата для того, чтобы укрепить нашу способность допросить основные механизмы адаптивного иммунного ответа. В то время как здесь акцент делается на активацию ^CD4 + Th1-типа эффектора / ячейки памяти, это основной подход можно легко модифицировать для изучения широкий спектр типов Т-клеток и AGS, как описано ниже.

Protocol

Все эксперименты, описанные в этом протоколе проводятся с первичных человеческих Т-клеток и коммерчески доступных первичных человеческих эндотелиальных клеток (кожная или легких микрососудистой ECS) Любой протокол исследования с участием человека должны быть одобрена этическим комитетом и пись…

Representative Results

Подход изображений роман помощью эндотелиальных клеток и сочетая преимущества разрешением плоской липидного бислоя модели с физиологический сложности и деформации профессиональной БТР был разработан (рисунок 1). Рисунок 2 приведены примеры типичн…

Discussion

В целом, этот протокол описывает методы исследования эндотелиальные клетки, как я) изученных физиологических БТР и II) в качестве нового типа из "плоского клеточной модели APC». Что касается первого, то стал все более и более очевидно, что без гемопоэтических периферических (или «строма…

Materials

BD Vacutainer stretch latex free tourniquet	BD Biosciences	367203
BD alcohol swabs	BD Biosciences	326895
BD Vacutainer Safety-Lok	BD Biosciences	367861	K2 EDTA
BD Vacutainer Push Button Blood Collection Set	BD Biosciences	367335
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R8758-1L
Ficoll-Paque	Sigma-Aldrich	GE17-1440-02	Bring to RT before use
FCS-Optima	Atlanta Biologics	s12450	Heat inactivated
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154-20ML
staphylococcal enterotoxin B	Toxin Technology	BT202RED	Stock solution 1mg/ml in PBS
toxic shock syndrome toxin 1	Toxin Technology	TT606RED	Stock solution 1mg/ml in PBS
human IL-15	R&D Systems	247-IL-025	Stock solution 50ug/ml in PBS
PBS	Life Technologies	10010-049
Fibronectin	Life Technologies	33016-015	Stock solution 1mg/ml in H20
HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells	Lonza	CC-2543	Other Human Microvascular ECs can be used, i.e. HLMVECs
EGM-2 MV bullet kit	Lonza	CC-3202
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T-4174	Stock solution 10x, dilute in PBS
amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit	Lonza	vpb1003	Required Kit for step 4
IFN-g	Sigma-Aldrich	I3265	Stock solution 1mg/ml in H20
TNF-alpha 10ug, human	Life Technologies	PHC3015	Stock solution 1mg/ml in H20
phenol Red-free HBSS	Life Technologies	14175-103
Hepes	Fisher Scientific	BP299-100
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C1016-100G	Stock solution 1M in H20
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	208337	Stock solution 1M in H20
Human Serum albumin	Sigma-Aldrich	A6909-10ml
Immersol 518 F fluorescence free Immersion oil	Fisher Scientific	12-624-66A
Fura-2 AM 20x50ug	Life Technologies	F1221	Stock solution 1mM in DMSO
pEYFP-Mem (Mem-YFP)	Clontech	6917-1
pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed)	Clontech	632466
pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed)	Clontech	632512
pEGFP-Actin	Clontech	6116-1
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Life Technologies	A12379
Formaldehyde solution 37%	Fisher Scientific	BP531-500	Toxic, use fumehood
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-5ML
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-70C
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-49A
Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25	Fisher Scientific	10-126-9
Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75	Fisher Scientific	13-680-65
Corning Cell Culture Treated T175	Fisher Scientific	10-126-61
Glass coverslips	Fisher Scientific	12-545-85	12 mm diameter
Falcon Tissue Culture Plates 24-well	Fisher Scientific	08-772-1
Delta-T plates	Bioptechs	04200415B
Wheaton Disposable Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-8D
1.5 ml Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-402-25
ICAM1 mouse anti-human	BD Biosciences	555509
HS1 mouse anti-human	BD Biosciences	610541
Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified	ebioscience	BMS102
Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488	ebioscience	53-0037-41
Anti-MHC Class II antibody	Abcam	ab55152
Anti-Talin 1 antibody	Abcam	ab71333
Anti-PKC theta antibody	Abcam	ab109481
phosphotyrosine (4G10 Platinum)	Millipore	50-171-463
Nucleofector II	Amaxa Biosystems		Required electroporator for step 4
Zeiss Axiovert	Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss LSM510	Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss Axiovison Software	Carl Zeiss MicroImaging
NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet	NuAIRE	Nu-425-600
Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Cell culture Incubator	Fisher Scientific	202370
Centrifuge 5810	Eppendorf	EW-02570-02
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line Hemocytometer
Isotemp Waterbath model 202	Fisher Scientific	15-462-2