High throughput<em> Danio rerio</em> Energi Udgifter Assay
Summary
Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.
Abstract
Zebrafisk er en vigtig model organisme med iboende fordele, der har potentiale til at zebrafisk en almindeligt anvendt model til undersøgelse af energihomeostase og fedme. Den lille størrelse af zebrafisk muliggør analyser på embryoner, der skal udføres i en 96- eller 384-brønds plade-format, Morpholino og CRISPR baserede teknologier fremmer nem genetisk manipulation, og medicinsk behandling ved bad ansøgning er levedygtig. Desuden zebrafisk er ideelle til forward genetiske skærme giver mulighed for hidtil ukendt gen opdagelse. I betragtning af den relative nyhed af zebrafisk som model for fedme, er det nødvendigt at udvikle værktøjer, der fuldt ud udnytter disse fordele. Heri beskriver vi en metode til at måle energiforbruget i tusindvis af embryonale zebrafisk samtidigt. Vi har udviklet et helt dyr mikroplade platform, hvor vi bruger 96-brønds plader for at isolere enkelte fisk og vi vurderer kumulative NADH 2-produktion ved hjælp af kommercielt tilgængelige cellekultur levedygtighed reagent alamarBlue. I poikilotherms forholdet mellem NADH 2-produktion og energiforbrug er tæt forbundet. Dette energiforbrug assay skaber potentiale til hurtigt at screene farmakologiske eller genetiske manipulationer, der direkte ændrer energiforbrug eller ændre respons på en anvendt lægemiddel (f.eks insulinsensibilisatorer).
Introduction
Musen er i øjeblikket den fremherskende model for fedme forskning. Den korte generationstid interval og genetiske værktøjer til rådighed i musen har været uovertruffen til dato. Dog zebrafisk har også en kort generation interval (3 – 4 måneder), og overgår endda musen i lethed genmanipulation 1,2. Zebrafisken fastholder næsten 90% af pattedyrsgener, mens langt overstiger musen i antallet af afkom og potentiel til brug i genetiske og narkotika skærme 3.
For at udnytte potentialet i den zebrafisk model til studier i fedme, skal analyser udvikles til at undersøge faktorer, der påvirker kropsvægten regulering, herunder energiforbrug. Som metabolitter behandles gennem β-oxidation og tricarboxylsyrecyklen oxygen forbruges og NADH2 produceres. Således NADH 2 er en direkte indikator for fluxen af metabolitter gennem metaboliske veje (metabolit oxidation). I poikilotherms, H + lække gennem den indre mitokondrielle membran, som kobler NADH2 oxidation fra ATP-syntese, er 4 – 5 gange lavere end i homeotherms 4. Følgelig i zebrafisk NADH2 er meget tæt knyttet til ATP-produktion ved oxidativ phosphorylering. Heri beskriver vi en analyse, der måler NADH 2 produktion i larvernes zebrafisk som proxy for energiforbrug 5.
Ilt forbrug er den gyldne standard for måling energiforbrug. Men for bedst at udnytte den høje gennemløb potentiale zebrafisk, skal assays af energiforbrug kunne underkastes high-throughput. Systemer iltforbrug der er afhængige af et lukket kammer cirkulationssystem er begrænset i gennemløb med antallet af kamre disponible 6. Open air O 2 forbrug / CO 2 produktions-analyser er også blevet anvendt i zebrafisk 5,7. Disse open air 96-brønds plade basend systemer er egnede til high throughput. Desværre gasudveksling med omgivelserne begrænser følsomheden af disse assays. Vi har for nylig offentliggjort anvendelsen af et assay, der overvåger NADH 2 under anvendelse af redoxindikator alamarBlue 5. Denne analyse overvinder begrænsningerne i gennemløb og følsomhed fælles for analyser af ilt forbrug i zebrafisk.
Zebrafisken bliver en stadig vigtigere model til studier af hele kroppen energi homøostase. Til dels, fordi zebrafisk er medgørlige at bruge i forward genetiske skærme og narkotika skærme. Desuden målrettet genetisk manipulation, herunder knockdown og knock-in, kan hurtigt anvendes. Vi har tidligere vist, at dette assay kan kombineres med bad lægemiddeltilførsel og genetisk knockdown eller knockout at identificere forbindelser og gener der ændrer stofskifte 5. Endvidere er dette assay udviklet til at udnytte de høje gennemløb fordele forbundet med zebrafisk. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
Forurening med bakterier eller svampe i høj grad vil begrænse anvendelsen af dette assay. Methylenblåt i E3 embryo medium begrænser muligheden for svampekontamination. Gennem embryo opdræt er det afgørende, at der drages omsorg for at fjerne døde fostre to gange hver dag. Derudover er det vigtigt at skylle dem grundigt embryonerne med sterilt E3 embryo medium på dagen for assayet indledning. Disse 2 trin begrænse muligheden for bakteriel kontaminering af embryonerne. Optagelse af tomme brønde beskrevet i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Drs. Roger Cone and Chao Zhang for their contributions to validating the application of this assay as previously published. This work was supported by NIH 1F32DK082167-01 (BJR).
Materials
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fine Tip DisposableTransfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-26 | Manufactured by Thermo Scientific |
| Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-771-9AM | Manufactured by Thermo Scientific |
| Black sided clear bottom 96-well plates | Fisher Scientific | 50-320-785 | Manufactured by E&K Scientific Products Inc. |
References
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. PNAS. 110, 13904-13909 (2013).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Sci. Rep. 4, 6545 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile. Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).
- Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish. Zebrafish. 10, 343-352 (2013).
- Livingston, R. J. A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals. J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).
- Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish. J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53, 161-168 (2012).
- Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish, A practical approach. , (2002).
- Fry, F. E. J., Hart, J. S. Cruising speed of goldfish in relation to water temperature. J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC physiol. 10 (21), (2010).
- Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).
- Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner. Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).
- Flynn, E. J., Trent , C. M., Rawls, J. F. Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio). J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).
- Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PloS one. 7, e52549 (2012).
- Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity. J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).
