בתארו תקנה Dependent גורם שעתוק של transcriptome MicroRNA
Summary
Herein we propose a strategy to study the effect of a transcription factor of interest on the microRNA transcriptome using publically available data, computational resources and high throughput data from microRNA arrays after transfecting cells with small hairpin (sh)RNA targeting a transcription factor of interest.
Abstract
בעוד תקנה שעתוק של גנים המקודדים חלבונים נחקרה בהרחבה, מעט מאוד ידוע על איך גורמי שעתוק המעורבים שעתוק של RNA ללא קידוד, במיוחד של מיקרו-רנ"א. כאן, אנו מציעים אסטרטגיה ללמוד את התפקיד הפוטנציאלי של גורם שעתוק בוויסות שעתוק של מיקרו RNA באמצעות נתונים זמינים לציבור, משאבים חישוביים ונתונים קצב העברת נתונים גבוה. אנו משתמשים חתימת אפיגנטיים H3K4me3 לזהות יזמי microRNA ו immunoprecipitation הכרומטין (שבב) נתוני -sequencing מפרויקט קידוד לזהות יזמי microRNA מעשירים עם גורם שעתוק אתרי קישור. על ידי transfecting תאים בעלי עניין עם shRNA מיקוד גורם שעתוק של עניין והכפפת התאים למערך microRNA, אנחנו לומדים את השפעת גורם שעתוק זה על transcriptome microRNA. כדוגמא המחשה נשתמש המחקר שלנו על השפעת STAT3 על transcriptome microRNA של ly הכרוניתלוקמיה mphocytic (CLL) תאים.
Introduction
מייקרו RNA הוא RNAs רגולטוריות קידוד הלא קטן אנדוגני כי בדרך כלל לתפקד כמו רגולטורים שליליים של ביטוי mRNA ברמת posttranscriptional. כ -1,000 ללא קידוד 20 עד 25 מיקרו-רנ"א ארוך נוקלאוטיד נמצאים בגנום האנושי 1,2. מיקרו RNA לווסת ביטוי גנים באמצעות זיווג בסיס הקנונית בין רצף זרע של microRNA ורצף המשחק זרע המשלים, הנמצא בדרך כלל על האזור מתורגמת '3 (UTR) של תעתיקי היעד. באופן קולקטיבי, מיקרו-רנ"א לווסת יותר מ -30% של הגנים המקודדים חלבונים 3, אבל רק מעט מאוד ידוע על שעתוק מ- DNA של מיקרו-רנ"א. הועלתה השערה כי הסדרת שעתוק microRNA דומה לזה של mRNA 4,5. בפרט, בדומה לפעילותה בקידום שעתוק של גנים המקודדים חלבונים, גורמי שעתוק נחשבים להפעיל שעתוק של מיקרו-רנ"א 6. תמלול גורם-מ 'גומלין icroRNA דווח כגורם אפנן של ביטוי גנים 7, והוא רשאי גם טופס היזון חוזר ולולאות-קדימה להאכיל. לדוגמה, Yamakuchi et al. דיווח לולאת משוב שבו p53 גורם הביטוי של microRNA34a, אשר בתורו מעכב תרגום של SIRT מדכא p53 ו- p53 ובכך להגדיל פעילות 8.
בעוד דוגמאות ספציפיות הביטוי תלויה גורם שעתוק של מיקרו-רנ"א דווחו, שיטה מקובלת המספק מידע על איך גורם שעתוק של עניין מסדיר את הביטוי של-transcriptome microRNA חסר. מטרת הפרוטוקול הציע בזאת היא לספק תיאור המעמיק של רגולציה גורמת תלויה שעתוק של-transcriptome microRNA. על ידי שילוב של נתונים זמינים לציבור, כלי ביואינפורמטיקה בטכנולוגיית microarray, חוקרים העוקבים אחר אלגוריתם זה יהיה מסוגל לתפוס בסולם גנומי איך כלגורם שעתוק לכל סוג תא של עניין מסדיר את הביטוי של transcriptome-microRNA וכדי לחקור תרומה משוערת של mRNA-גורם שעתוק ויסות ביטוי microRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
המנגנון שבבסיס RNA פולימראז II- השעתוק התלוי של גני המקודדים חלבונים, נחקר בהרחבה. בעוד אלמנטים אלה מהווים רק 1% – 2% של הגנום האנושי, ראיות מפרויקט הקידוד מראים כי למעלה מ -80% של הגנום האנושי עשויים לעבור שעתוק 17 ומה מסדיר את התעתיק של רצפי דנ"א ללא קידוד נותר ברובה …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענק מטעם קרן המחקר גלובל CLL. האוניברסיטה של מרכז טקסס MD Anderson Cancer נתמך בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב באמצעות מענק תמיכה במרכז לחקר הסרטן (P30CA16672).
Materials
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| 0.45 um syringe filter | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
| Amicon ultracentrifugal filter device with threshold of 100kDa | Merck Millipore | ||
| Polybrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| TRIzol reagent | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
| 293 Cell line human | Sigma-Aldrich | 85120602 |
References
- Bentwich, I., et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 37, 766-770 (2005).
- Hata, A. Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease. Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences. Biol Direct. 6, 61 (2011).
- Rozovski, U., et al. Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells. Mol Cancer. 12, 50 (2013).
- Turner, M. J., Slack, F. J. Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding. RNA Biol. 6, 49-53 (2009).
- Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity. Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).
- Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop. Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).
- Baer, C., et al. Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).
- Hazan-Halevy, I., et al. STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells. Blood. 115, 2852-2863 (2010).
- Melo, S. A., et al. A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function. Nat Genet. 41, 365-370 (2009).
- Akira, S. Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice. Stem Cells. 17, 138-146 (1999).
- Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues. J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).
- Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).
- Consortium, E. P. A user’s guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS biology. 9, e1001046 (2011).
- Miranda, K. C., et al. A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes. Cell. 126, 1203-1217 (2006).
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, 57-74 (2012).
- Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene. Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).
- Corcoran, D. L., et al. Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data. PLoS One. 4, e5279 (2009).
- Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection. Stat Appl Genet Mol Biol. 11, (2012).
