Beskriver en Transskription Factor Afhængig forordning af MicroRNA Transkriptomet
Summary
Herein we propose a strategy to study the effect of a transcription factor of interest on the microRNA transcriptome using publically available data, computational resources and high throughput data from microRNA arrays after transfecting cells with small hairpin (sh)RNA targeting a transcription factor of interest.
Abstract
Mens transkriptionen regulering af proteinkodende gener grundigt undersøgt, vides der kun lidt om, hvordan transkriptionsfaktorer er involveret i transkription af ikke-kodende RNA'er, specielt af microRNA. Her foreslår vi en strategi for at studere den potentielle rolle af transskription faktor i reguleringen transskription af microRNA bruger offentligt tilgængelige data, it-ressourcer og høj data. Vi bruger H3K4me3 epigenetiske signatur til at identificere microRNA initiativtagere og kromatin immunofældning (chip) -sequencing data fra KODE projektet at identificere microRNA initiativtagere, der er beriget med transskription faktor bindingssteder. Ved transfektion af celler af interesse med shRNA rettet mod en transkriptionsfaktor af interesse og underkaste cellerne til microRNA array, studerer vi effekten af denne transkriptionsfaktor på microRNA transkriptom. Som et illustrativt eksempel bruger vi vores undersøgelse af effekten af STAT3 på microRNA transkriptomet af kronisk lymphocytic leukæmi (CLL) celler.
Introduction
MikroRNA'er er endogene små ikke kodende regulatoriske RNA'er, der typisk fungerer som negative regulatorer af mRNA-ekspression på posttranskriptionel niveau. Ca. 1.000 ikke-kodende 20 til 25 nukleotid lange microRNA'er findes i det humane genom 1,2. MikroRNA'er regulere genekspression gennem kanonisk baseparring mellem frøet sekvens af microRNA og dens komplementære frø match sekvens, som er almindeligt placeret i 3'-utranslaterede område (UTR) af mål-mRNA'er. Kollektivt, microRNA regulere mere end 30% af protein-kodende gener 3, men kun lidt er kendt om transkriptionen fra DNA af microRNA. Det er blevet foreslået, at reguleringen af microRNA transkription svarer til den af mRNA 4,5. Især ligner sin virksomhed i at fremme transskription af protein kodning gener, er transkriptionsfaktorer menes at aktivere transkription af microRNA 6. Transkriptionsfaktor-microRNA samspil er blevet rapporteret som en modulator faktor af genekspression 7, og kan også danne feedback og feed-forward sløjfer. F.eks Yamakuchi et al. Rapporterede en tilbagekoblingssløjfe, hvor p53 inducerer ekspressionen af microRNA34a, hvilket igen hæmmer translation af p53 repressor SIRT og derved øge p53 aktivitet 8.
Ud fra følgende betragtninger konkrete eksempler på transskription faktor afhængig udtryk for microRNA er blevet rapporteret, er en accepteret metode, som beskriver, hvordan en transkriptionsfaktor af interesse regulerer ekspressionen af microRNA-transkriptomet mangler. Formålet med protokollen foreslået heri er at give en grundig beskrivelse af transskription faktor-afhængig regulering af microRNA-transkriptomet. Ved at kombinere offentligt tilgængelige data, bioinformatik værktøjer og hjælp microarray teknologi, ville forskere, der følger denne algoritme kunne fange på en genomisk skala hvordan enhvertranskriptionsfaktor i enhver celletype af interesse regulerer ekspressionen af microRNA-transkriptom og at undersøge et formodet bidrag af transkriptionsfaktoren-mRNA i reguleringen microRNA ekspression.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mekanismen bag RNA-polymerasen II afhængig transskription af proteinkodende gener er blevet grundigt undersøgt. Selv om disse elementer udgør kun 1% – 2% af det humane genom, beviser fra KODE projektet antyder, at over 80% af det humane genom kan undergå transkription 17 og hvad regulerer transskriptionen af de ikke-kodende DNA-elementer forbliver stort set ukendt 6 .
Flere undersøgelser, der indikerede, at Pol II er også ansvarlig for transskription af nogle ikke…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra CLL Global Research Foundation. The University of Texas MD Anderson Cancer Center understøttes delvist af National Institutes of Health gennem en Cancer Center Support Grant (P30CA16672).
Materials
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| 0.45 um syringe filter | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
| Amicon ultracentrifugal filter device with threshold of 100kDa | Merck Millipore | ||
| Polybrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| TRIzol reagent | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
| 293 Cell line human | Sigma-Aldrich | 85120602 |
References
- Bentwich, I., et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 37, 766-770 (2005).
- Hata, A. Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease. Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences. Biol Direct. 6, 61 (2011).
- Rozovski, U., et al. Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells. Mol Cancer. 12, 50 (2013).
- Turner, M. J., Slack, F. J. Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding. RNA Biol. 6, 49-53 (2009).
- Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity. Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).
- Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop. Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).
- Baer, C., et al. Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).
- Hazan-Halevy, I., et al. STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells. Blood. 115, 2852-2863 (2010).
- Melo, S. A., et al. A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function. Nat Genet. 41, 365-370 (2009).
- Akira, S. Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice. Stem Cells. 17, 138-146 (1999).
- Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues. J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).
- Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).
- Consortium, E. P. A user’s guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS biology. 9, e1001046 (2011).
- Miranda, K. C., et al. A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes. Cell. 126, 1203-1217 (2006).
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, 57-74 (2012).
- Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene. Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).
- Corcoran, D. L., et al. Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data. PLoS One. 4, e5279 (2009).
- Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection. Stat Appl Genet Mol Biol. 11, (2012).
