واصفا تنظيم النسخ عامل تابع للالرنا الميكروي Transcriptome على
Summary
Herein we propose a strategy to study the effect of a transcription factor of interest on the microRNA transcriptome using publically available data, computational resources and high throughput data from microRNA arrays after transfecting cells with small hairpin (sh)RNA targeting a transcription factor of interest.
Abstract
في حين تم دراسة تنظيم النسخ من البروتين الجينات الترميز على نطاق واسع، لا يعرف إلا القليل عن الكيفية التي تشارك عوامل النسخ في النسخ من الرنا غير الترميز، وتحديدا من microRNAs. هنا، نقترح استراتيجية لدراسة الدور المحتمل للعامل النسخ في تنظيم النسخ من microRNAs باستخدام البيانات المتاحة علنا والموارد الحاسوبية والبيانات إنتاجية عالية. نحن نستخدم التوقيع جينية H3K4me3 لتحديد المروجين الرنا الميكروي والكروماتين مناعي (رقاقة) البيانات -sequencing من مشروع ترميز لتحديد المروجين الرنا الميكروي التي المخصب مع مواقع عامل النسخ ملزمة. قبل transfecting الخلايا في المصالح مع shRNA استهداف عامل النسخ من الفائدة وتعريض الخلايا لالرنا الميكروي مجموعة، ونحن ندرس تأثير هذا العامل النسخ على Transcriptome على الرنا الميكروي. كمثال توضيحي نستخدم دراستنا حول تأثير STAT3 على Transcriptome على الرنا الميكروي من لاي المزمنسرطان الدم mphocytic (CLL) الخلايا.
Introduction
الرنا الميكروية هي الذاتية الرنا التنظيمية غير الترميز الصغيرة التي تعمل عادة المنظمين سلبية التعبير مرنا على مستوى posttranscriptional. ما يقرب من 1000 غير الترميز 20-25 النوكليوتيدات توجد الرنا الميكروية طويلة في الجينوم البشري 1،2. الرنا الميكروية تنظيم التعبير الجيني من خلال قاعدة الاقتران الكنسي بين تسلسل البذور من الرنا الميكروي ومكملة تسلسل مباراة بذوره، والذي يقع عادة في المنطقة غير مترجمة 3 '(UTR) من من mRNAs الهدف. بشكل جماعي، الرنا الميكروية تنظم أكثر من 30٪ من البروتين ترميز الجينات 3، ولكن لا يعرف سوى القليل عن النسخ من الحمض النووي من microRNAs. فقد قيل أن تنظيم الرنا الميكروي النسخ مماثلة لتلك التي من مرنا 4،5. على وجه الخصوص، على غرار نشاطها في تعزيز نسخ من جينات ترميز البروتين، ويعتقد أن عوامل النسخ لتفعيل النسخ من microRNAs 6. النسخ عامل متم الإبلاغ عن icroRNA التفاعل كعامل المغير في التعبير الجيني 7، ويمكن أن تشكل أيضا تغذية راجعة وحلقات التغذية إلى الأمام. على سبيل المثال، ذكرت Yamakuchi آخرون حلقة التغذية المرتدة التي البروتين p53 الحث على التعبير عن microRNA34a، وهذا بدوره يحول دون ترجمة سرت البروتين p53 كاظمة وبالتالي زيادة نشاط البروتين p53 8.
في حين تم الإبلاغ عن أمثلة محددة من عامل النسخ التعبير يعتمد من microRNAs، وهي طريقة مقبولة الذي يقدم معلومات عن كيف يمكن لعامل النسخ التي تهم ينظم التعبير عن الرنا الميكروي-Transcriptome على غير متوفرة. والغرض من هذا البروتوكول المقترح هنا هو تقديم وصف في عمق النسخ التي تعتمد على عامل تنظيم الرنا الميكروي-Transcriptome على. من خلال الجمع بين البيانات المتاحة علنا، وأدوات المعلوماتية الحيوية واستخدام تكنولوجيا متطورة، فإن الباحثين الذين يتابعون هذه الخوارزمية تكون قادرة على التقاط على نطاق الجينوم كيف يمكن لأيعامل النسخ في أي نوع من الخلايا في المصالح ينظم التعبير عن الرنا الميكروي-Transcriptome على ولاستكشاف مساهمة المفترضة من النسخ عامل مرنا في تنظيم التعبير الرنا الميكروي.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تمت دراسة الآلية الكامنة وراء RNA البلمرة ثانيا: النسخ يعتمد على البروتين الجينات الترميز على نطاق واسع. في حين أن هذه العناصر تشكل سوى 1٪ – 2٪ من الجينوم البشري، والأدلة من مشروع ترميز تشير إلى أن أكثر من 80٪ من الجينوم البشري قد تخضع النسخ 17 وما ينظم النسخ من عن…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة عن طريق منحة من مؤسسة الأبحاث العالمية CLL. ويدعم إم دي أندرسون في جزء من المعاهد الوطنية للصحة من خلال سرطان مركز دعم جرانت (P30CA16672).
Materials
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| 0.45 um syringe filter | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
| Amicon ultracentrifugal filter device with threshold of 100kDa | Merck Millipore | ||
| Polybrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| TRIzol reagent | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
| 293 Cell line human | Sigma-Aldrich | 85120602 |
References
- Bentwich, I., et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 37, 766-770 (2005).
- Hata, A. Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease. Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences. Biol Direct. 6, 61 (2011).
- Rozovski, U., et al. Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells. Mol Cancer. 12, 50 (2013).
- Turner, M. J., Slack, F. J. Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding. RNA Biol. 6, 49-53 (2009).
- Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity. Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).
- Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop. Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).
- Baer, C., et al. Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).
- Hazan-Halevy, I., et al. STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells. Blood. 115, 2852-2863 (2010).
- Melo, S. A., et al. A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function. Nat Genet. 41, 365-370 (2009).
- Akira, S. Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice. Stem Cells. 17, 138-146 (1999).
- Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues. J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).
- Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).
- Consortium, E. P. A user’s guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS biology. 9, e1001046 (2011).
- Miranda, K. C., et al. A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes. Cell. 126, 1203-1217 (2006).
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, 57-74 (2012).
- Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene. Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).
- Corcoran, D. L., et al. Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data. PLoS One. 4, e5279 (2009).
- Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection. Stat Appl Genet Mol Biol. 11, (2012).
