Beskrive en transkripsjonsfaktor Avhengig Regulering av mikroRNA transkriptom
Summary
Herein we propose a strategy to study the effect of a transcription factor of interest on the microRNA transcriptome using publically available data, computational resources and high throughput data from microRNA arrays after transfecting cells with small hairpin (sh)RNA targeting a transcription factor of interest.
Abstract
Mens transkripsjon regulering av proteinkodende gener ble grundig studert, er lite kjent om hvordan transkripsjonsfaktorer som er involvert i transkripsjon av ikke-kodende RNA, spesielt av microRNAs. Her foreslår vi en strategi for å studere potensielle rolle transkripsjonsfaktor i å regulere transkripsjon av microRNAs bruker offentlig tilgjengelige data, beregningsressurser og høy gjennomstrømning data. Vi bruker H3K4me3 epigenetisk signatur for å identifisere mikroRNA arrangører og kromatin immunoprecipitation (chip) -sequencing data fra KODE prosjekt for å identifisere mikroRNA arrangører som er beriket med transkripsjonsfaktor bindingssteder. Ved trans celler av interesse med shRNA targeting en transkripsjonsfaktor av interesse og å utsette cellene til mikroRNA array, studerer vi effekten av denne transkripsjonsfaktor på mikroRNA transkriptom. Som et illustrerende eksempel bruker vi vår undersøkelse på effekten av STAT3 på mikroRNA transkriptomet av kronisk lymphocytic leukemi (KLL) celler.
Introduction
MicroRNAs er endogene små ikke koding regulatoriske RNA som vanligvis fungerer som negative regulatorer av mRNA uttrykk ved posttranskripsjonelt nivå. Omtrent 1000 ikke-kodende 20 til 25 nukleotid lange microRNAs er funnet i det humane genomet 1,2. MicroRNAs regulere genekspresjon gjennom kanonisk baseparing mellom frø-sekvensen av mikroRNA og dens komplementære sekvens frø kamp, som vanligvis ligger i 3'-utranslatert region (UTR) av mål-mRNA. Kollektivt, microRNAs regulere mer enn 30% av proteinkodende gener 3, men bare lite er kjent om transkripsjon fra DNA av microRNAs. Det har blitt foreslått at reguleringen av mikroRNA transkripsjon er lik den til mRNA 4,5. Spesielt, i likhet med dets aktivitet i å fremme transkripsjon av protein-kodende gener, er transkripsjonsfaktorer antatt å aktivere transkripsjon av microRNAs 6. Transkripsjonsfaktor-microRNA samspillet har blitt rapportert som en modulator faktor av genekspresjon 7, og kan også danne feed-back og feed-frem sløyfer. For eksempel, Yamakuchi et al., Rapporterte en tilbakekoblingssløyfe hvori p53 induserer ekspresjon av microRNA34a, som i sin tur hindrer translasjon av p53-repressoren SIRT og derved øke p53 aktivitet 8.
Mens spesifikke eksempler på transkripsjonsfaktor avhengig uttrykk for microRNAs er rapportert, mangler en akseptert metode som gir informasjon om hvordan en transkripsjonsfaktor av interesse regulerer uttrykk av mikroRNA-transkriptom. Formålet med protokollen foreslått her, er å gi en grundig beskrivelse av transkripsjonsfaktor avhengig regulering av mikroRNA-transkriptom. Ved å kombinere offentlig tilgjengelige data, bioinformatikk og bruk av microarray teknologi, ville forskere som følger denne algoritmen kunne fange opp på en genomisk skala hvordan noentranskripsjonsfaktor i en hvilken som helst celletype av interesse regulerer ekspresjon av mikroRNA-transcriptome og for å utforske en antatt bidrag av transkripsjonsfaktor-mRNA i regulering mikroRNA uttrykk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mekanismen som ligger til grunn av RNA-polymerase II-avhengig transkripsjon av proteinkodende gener er blitt grundig undersøkt. Selv om disse elementene utgjør bare 1% – 2% av det humane genom, bevis fra ENCODE-prosjektet indikerer at over 80% av det humane genom kan gjennomgå transkripsjon 17 og det som regulerer transkripsjon av de ikke-kodende DNA-elementer som forblir stort sett ukjent 6 .
Flere studier, som indikerte at Pol II er også ansvarlig for transkripsjo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av en bevilgning fra KLL Global Research Foundation. The University of Texas MD Anderson Cancer Center støttes delvis av National Institutes of Health gjennom en Cancer Center Support Grant (P30CA16672).
Materials
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| 0.45 um syringe filter | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
| Amicon ultracentrifugal filter device with threshold of 100kDa | Merck Millipore | ||
| Polybrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| TRIzol reagent | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
| 293 Cell line human | Sigma-Aldrich | 85120602 |
References
- Bentwich, I., et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 37, 766-770 (2005).
- Hata, A. Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease. Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences. Biol Direct. 6, 61 (2011).
- Rozovski, U., et al. Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells. Mol Cancer. 12, 50 (2013).
- Turner, M. J., Slack, F. J. Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding. RNA Biol. 6, 49-53 (2009).
- Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity. Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).
- Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop. Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).
- Baer, C., et al. Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).
- Hazan-Halevy, I., et al. STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells. Blood. 115, 2852-2863 (2010).
- Melo, S. A., et al. A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function. Nat Genet. 41, 365-370 (2009).
- Akira, S. Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice. Stem Cells. 17, 138-146 (1999).
- Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues. J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).
- Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).
- Consortium, E. P. A user’s guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS biology. 9, e1001046 (2011).
- Miranda, K. C., et al. A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes. Cell. 126, 1203-1217 (2006).
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, 57-74 (2012).
- Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene. Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).
- Corcoran, D. L., et al. Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data. PLoS One. 4, e5279 (2009).
- Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection. Stat Appl Genet Mol Biol. 11, (2012).
