Descripción de una regulación dependiente de factor de transcripción del transcriptoma MicroARN
Summary
Herein we propose a strategy to study the effect of a transcription factor of interest on the microRNA transcriptome using publically available data, computational resources and high throughput data from microRNA arrays after transfecting cells with small hairpin (sh)RNA targeting a transcription factor of interest.
Abstract
Mientras que la regulación de la transcripción de genes que codifican proteínas se estudió extensamente, poco se conoce sobre cómo los factores de transcripción están implicados en la transcripción de los ARN no codificantes, específicamente de microARN. A continuación, se propone una estrategia para estudiar el posible papel del factor de transcripción en la regulación de la transcripción de microRNAs utilizando los datos públicamente disponibles, los recursos computacionales y de datos de alto rendimiento. Utilizamos la firma epigenética H3K4me3 para identificar promotores de microARN y la cromatina immunoprecipitation (CHIP) -sequencing datos del proyecto ENCODE para identificar promotores de microARN que se enriquecen con los sitios de unión del factor de transcripción. Mediante la transfección de células de interés con shRNA dirigidas a un factor de transcripción de interés y someter las células a la matriz microARN, se estudia el efecto de este factor de transcripción en el transcriptoma de microARN. A modo de ejemplo ilustrativo usamos nuestro estudio sobre el efecto de STAT3 en el transcriptoma de microARN Ly crónicaleucemia mphocytic (LLC) de células.
Introduction
Los microARN son ARN reguladoras no codificantes pequeñas endógenos que normalmente funcionan como reguladores negativos de la expresión de ARNm a nivel postranscripcional. Aproximadamente 1000 no codificante de 20 a 25 nucleótidos microRNAs largos se encuentran en el genoma humano 1,2. MicroARNs regulan la expresión génica a través de apareamiento de bases entre la secuencia canónica semilla de la microRNA y su secuencia complementaria partido de semillas, que comúnmente se encuentra en la región no traducida 3 '(UTR) de los ARNm diana. Colectivamente, microRNAs regulan más de 30% de los genes de codificación de proteínas 3, pero sólo se conoce poco acerca de la transcripción a partir del ADN de microARN. Se ha sugerido que la regulación de la transcripción microRNA es similar a la de mRNA 4,5. En particular, similar a su actividad en la promoción de la transcripción de genes de codificación de proteínas, se cree que los factores de transcripción para activar la transcripción de microRNAs 6. Factor de Transcripción-microRNA interacción ha sido reportado como un factor modulador de la expresión génica 7, y también pueden formar feed-back y bucles de alimentación hacia adelante. Por ejemplo, Yamakuchi et al. Informó de un bucle de retroalimentación en el que p53 induce la expresión de microRNA34a, que a su vez inhibe la traducción de la SIRT p53 represor y aumentando de este modo la actividad de p53 8.
Considerando que se han reportado ejemplos específicos de expresión dependiente de factor de transcripción de los microARN, un método aceptado que proporciona información sobre cómo un factor de transcripción de interés regula la expresión del microARN-transcriptoma es insuficiente. El propósito del protocolo sugerido en este documento es proporcionar una descripción en profundidad de la transcripción de la regulación dependiente del factor de la microRNA-transcriptoma. Al combinar los datos públicamente disponibles, herramientas bioinformáticas y el uso de la tecnología de microarrays, los investigadores que siguen este algoritmo sería capaz de capturar en una escala genómica cómo cualquierfactor de transcripción en cualquier tipo de célula de interés regula la expresión de la microRNA-transcriptoma y para explorar una contribución putativa del factor de transcripción-mRNA en la regulación de la expresión de microARN.
Protocol
Representative Results
Discussion
El mecanismo subyacente a la polimerasa de transcripción de ARN II- dependiente de proteínas de codificación de genes ha sido ampliamente estudiado. Si bien estos elementos constituyen sólo el 1% – 2% del genoma humano, la evidencia del proyecto ENCODE sugieren que más del 80% del genoma humano puede someterse a transcripción 17 y lo regula la transcripción de los elementos de ADN no codificantes sigue siendo en gran parte desconocida 6 .
Varios estudios, que ind…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por una beca de la Fundación de Investigación Global de la LLC. La Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center está apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud a través de un Centro de Grant la ayuda del cáncer (P30CA16672).
Materials
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| 0.45 um syringe filter | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
| Amicon ultracentrifugal filter device with threshold of 100kDa | Merck Millipore | ||
| Polybrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| TRIzol reagent | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
| 293 Cell line human | Sigma-Aldrich | 85120602 |
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