Précis et phénol libre ADN sexage des embryons de porcins Jour 30 par PCR

Summary

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

Abstract

La recherche sur la programmation prénatale chez le porc a montré que le sexe de l'embryon ou du foetus peut influencer le résultat du développement. Par conséquent, la capacité de déterminer le sexe d'un embryon est nécessaire dans de nombreuses expériences en particulier en ce qui concerne le développement des jeunes. Le présent protocole démontre une préparation peu coûteuse, rapide et non-toxique de l'ADN génomique de porc pour une utilisation avec la PCR. Jour 30 embryons doivent être humainement collectées selon les lignes directrices établies par des institutions politiques relatives aux animaux et comités de protection pour le présent protocole. La préparation de l'embryon entier de cette technique basée sur la PCR de sexage consiste simplement en broyant le embryons congelés en une poudre fine en utilisant un mortier pré-refroidi et un pilon. ADN par PCR qualité est libéré à partir d'une petite quantité de poudre d'embryons par application d'une incubation à chaud dans un réactif de lyse alcaline. Ensuite, la solution d'ADN est mélangé avec un tampon de neutralisation et utilisé directement pour la PCR. Deux paires d'amorces sont générés pour DETECSexospécifiques t déterminer région du chromosome Y (SRY) et la région ZFX du chromosome X avec une grande précision et de spécificité. Le même protocole peut être appliqué à d'autres embryons allongés (de jour 10 et le jour 14) jours au plus tôt 30. En outre, ce protocole peut être réalisée avec des plaques de 96 jailli lors de la sélection d'un grand nombre d'embryons, ce qui rend possible pour l'automatisation et la haute débit typage sexe.

Introduction

Le porc domestique est devenue un sujet de recherche fondamentale dans le développement, la génétique et de la nutrition dans les deux secteurs de l'homme et le bétail. Le potentiel de porcs comme modèles biomédicaux pour la recherche humaine peut être attribuée à leurs similitudes physiologiques. Dans l'élevage, la manipulation de la sex-ratio peut améliorer l'efficacité de sélection et d'amélioration génétique des programmes ^1. Sexage des embryons individuels est un outil fondamental utilisé dans de nombreuses études expérimentales, y compris, mais sans s'y limiter, le génotype, l'épigénétique et X inactivation du dimorphisme sexuel au début du développement embryonnaire ^2.

Études chez la souris suggèrent que le régime alimentaire de la mère et d'autres facteurs peuvent entraîner un déséquilibre entre les sexes ^3. Chez les porcs, les causes de sex-ratio déséquilibre comprennent race paternelle ^4, la capacité de l'utérus ^5, et l'état métabolique de la truie ^6. Étant donné que les différences observées dans les embryons et les portées peuvent être influencés par soixual dimorphisme, les chercheurs doivent être conscients de l'embryon de sexe et les rapports sexuels avant de tirer des conclusions au sujet de leur recherche. Le développement d'outils et de protocoles efficaces pour le sexage des embryons de porcs au jour 30 du développement sera discuté ici.

Diverses méthodes de typage du sexe ont été développés pour les études génétiques chez les organismes modèles et le bétail. En particulier dans l'élevage, l'identification des embryons précoces, hommes et femmes est une pratique très courante pour améliorer la sélection génétique pour les programmes de sélection. Embryons précoces caryotype chez le porc en utilisant Giemsa ^{7 ou} la fluorescence intense ^8,9 techniques ont été utilisées pour le typage de sexe. Cependant, ces méthodes prennent beaucoup de temps et ne conviennent pas pour le criblage de grands nombres d'embryons rapidement et avec précision.

Le procédé de typage de sexe le plus efficace est l'amplification d'ADN en utilisant une ADN polymérase stable à la chaleur et une paire d'amorces. ADN sexage par la méthode PCR est plus spécifique, rapide et sensible, onécessitant eul une infime quantité de matériaux cellulaires. La première sexage des embryons par PCR a été effectuée sur des êtres humains ^10, et plus tard chez la souris ^11, les bovins, les buffles ^{12 13 et 14} moutons embryons pré-implantatoire. Chez le porc, la méthode de typage de l'ADN du sexe plus tôt a été établi pour les embryons de pré-implantation par une seule paire de chromosome Y amorces d'ADN spécifiques ^15. Cependant, des amorces de PCR les plus courantes pour la détermination du sexe ont été choisis dans le chromosome Y du gène SRY spécifique mâle ^{16 et la} non-sex région discriminante d'un gène à doigt de zinc située à la fois X et Y ^{chromosome 17.} Par la suite, ces amorces ont été appliqués pour déterminer le sexe d'embryons du jour 30 dans la présente étude avec une meilleure spécificité des amorces pour détecter uniquement le chromosome X d'un gène à doigt de zinc.

L'ADN génomique de porc embryons pré-implantation peut être extraite par l'exposition d'un blastocyste intact pour tamponner avec proteinase K ¹⁶ ou en prenant une biopsie de quelques cellules de la coupure rapide individuelle embryons de ¹⁵ et de les utiliser pour la PCR directe. Cependant, la libération de l'ADN à partir de sang de porc, les cheveux, les tissus ou une grande conceptus sur quelques centimètres dans la taille est pas effectivement fait en utilisant la méthode protéinase K. Méthodes d'extraction de l'ADN de ces matériaux ont été créés en utilisant soit chronophages protocoles phénol / chloroforme ^{6 ou} des kits basés colonne coûteuse ^18. Afin d'éviter l'utilisation de produits chimiques potentiellement toxiques, il y a une tendance à développer des méthodes d'extraction d'ADN faciles et sans phénol peu coûteux. Ce type de protocole pour l'isolement de l'ADN génomique par PCR qualité de la souris ^{19 et} de poisson zèbre ²⁰ tissus a été établie à l'aide d'hydroxyde de sodium chaud et Tris (champion). Cette étude fournit un protocole pour obtenir de l'ADN avec des paires d'amorces duplex modifiés champion et redessinés pour le sexe PCR tapant directement à partir de lysats cellulaires de Jour 30 embryons de porc avechaute précision.

Protocol

En accord avec le Conseil canadien sur les directives de protection des animaux et avec l'approbation de la politique animale Faculté Comité social et – l'élevage de l'Université de l'Alberta, les truies gestantes ont été euthanasiés par le personnel formé à environ 30 jours de la grossesse et embryons ont été collectés. Utilisez des gants d'examen à tout moment pendant les procédures. 1. Prélèvement et stockage des échantillons Euthanasier truie par cheville percu…

Representative Results

Un résultat représentatif de la détermination du sexe de l'ADN des lysats 345 criblage par PCR est montrée à la figure 7 et résumées dans le tableau 1. Comme on peut le voir sur la figure 7, la température d'annelage des amorces à 65 ° C est la condition optimale dans ce protocole PCR générer la même intensité et la taille des amplicons prédites …

Discussion

La plupart des protocoles existants en matière de sexe porcine typage de l'ADN des embryons ne conviennent qu'aux stade précoce stade pré-implantatoire ^15,16. Nous avons développé avec succès un protocole approprié pour le dépistage des embryons de porc en fin de gestation. Basé sur des études avec des stades de développement similaires d'embryons provenant d'études précédentes ^6,18, le présent protocole est considéré comme plus sûr et à faible coût.

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Materials

KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit	KAPABiosystems	KR0370	other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization
SYBR Safe DNA Gel Stain	Life Technologies	S33102	Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe
Pig female and male genomic DNA	Zyagen	GP-160-F1 & GP-160-M5	Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.
Typhoon FLA 9500 laser scanner	GE Healthcare Life Sciences	28-9969-43	other imaging system can be used
Free Soft Nitrile Examination Gloves	WWR	89038-270	any other examination glove can be used
Sodium hydroxide, solid	Fisher	BP 359 -212	Molecular Biology Grade
Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean	Eppendorff	0030 108.051	heat resistant
ThermoStat plus	Eppendorff	22670204	Use as a incubator for 95C, don't need to use the heater
Toothpick	Bunzl Plc	75200815	Any round wooden toothpicks can be used – quality wood
Microcentrifuge 5417R/5417C	Eppendorff	22621807	This model was discontinued. But another newer model can be used
Microspatula	Fisher	SDI28540115	Autoclaved before use each time.