PCRによる日30ブタ胚の正確かつフェノールフリーDNA雌雄鑑別
Summary
This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.
Abstract
豚における出生前のプログラミングの研究は、胚または胎児の性別が発達アウトカムに影響を与えることができることを示しています。したがって、胚の性別を決定する能力は、特に初期の開発に関する多くの実験に必要です。本プロトコルは、PCRで使用するための豚ゲノムDNAの、安価で迅速かつ非毒性の製造を示します。 30日目の胚は、人道的に存在するプロトコルのために施設内動物政策と福祉委員会によって確立されたガイドラインに従って収集されなければなりません。このPCRベースの雌雄鑑別技術のための全胚の作成は、単純にあらかじめ冷却し、乳鉢と乳棒を用いて微細な粉末に凍結した胚を粉砕することを含みます。 PCR品質のDNAをアルカリ溶解試薬ホットインキュベーションを適用することによって、胚の粉末の少量から放出されます。次に、DNA溶液を中和緩衝液と混合し、PCRに直接使用しました。二つのプライマー対はdetecに生成されます高精度と特異性を有するX-染色体のY-染色体（SRY）とZFX領域の領域を決定トン特定セックス。同じプロトコルをまた、30日目より前の他の細長い胚（14日目まで10日目）に適用することができ、胚の多数をスクリーニングする自動化が可能作り、高場合、このプロトコルは、96 welledプレートで実施することができますスループットセックスタイピング。
Introduction
家畜ブタはヒトおよび家畜の分野での開発、遺伝学や栄養学の基本的な研究テーマとなっています。人間の研究のための生物医学モデルとして豚の電位は、それらの生理学的類似性に起因することができます。家畜では、性比の操作は、選択と遺伝的改良プログラム1の有効性を高めることができます。個々の胚を雌雄鑑別することは、遺伝子型、エピジェネティクスと初期胚の発育2時の性的二型のX不活性化を含むがこれらに限定されない多くの実験的調査に使用される基本的なツールです。
マウスでの研究は、母体の食事やその他の要因は男女の不均衡3をもたらし得ることを示唆しています。豚では、男女比の不均衡の原因は父方の品種4、子宮容量5と、母豚の代謝条件6が含まれます 。胚および同腹仔で観察された差異は、それ自体によって影響され得るのでxual二形は、研究者が自分の研究に関する結論を描画する前に胚のセックスと性比に注意する必要があります。開発の30日目にブタの胚を雌雄鑑別するための効率的なツールやプロトコルの開発は、ここで議論されます。
セックスタイピングの様々な方法がモデル生物と家畜の遺伝的研究のために開発されてきました。特に家畜で、男性と女性の初期胚を識別することは繁殖プログラムのための遺伝子選択性を高めるために非常に一般的です。ギムザ7または8,9の技術はセックスタイピングのために使用されている強い蛍光を使用して、ブタにおける初期胚の染色体分析。しかしながら、これらの方法は時間がかかり、迅速かつ正確に胚の多数をスクリーニングするには適していません。
最も効果的な性別のタイピング方法は、熱安定性DNAポリメラーゼおよびプライマーの対を用いてDNAの増幅です。 PCR法によるDNAの雌雄鑑別は、o-、より、具体的な迅速かつ高感度でありますNLY細胞物質の微量を必要とします。最初のPCRベースの胚性判別は、ヒト10、およびそれ以降のマウスでは11、牛12、水牛13と羊14着床前胚で実施しました。豚では、最古のDNAのセックスタイピング法は、Y染色体特異的なDNAプライマー15の単一の対を介して着床前胚のために設立されました。しかし、性別決意のための最も一般的なPCRプライマーは、雄特異的なSRY遺伝子16とXとY染色体17の両方に位置するジンクフィンガー遺伝子の非性別判別領域のY染色体から選択しました。その後、これらのプライマーは、ジンクフィンガー遺伝子の唯一のX-染色体を検出するためのプライマーの改善された特異性を持つこの研究で30日目の胚の性別を決定するために適用されてきました。
ブタ着床前胚からのゲノムDNAをproteinasでバッファする無傷の胚盤胞を露出することによって抽出することができますE K 16または15個々の初期卵割胚から少数の細胞の生検を取り、直接PCRのためにそれらを使用します。しかし、大きさが数センチメートル以上ブタ血液、毛髪、組織または大受胎からのDNAの放出を効果的にプロテイナーゼK法を使用して行われていません。これらの材料のためのDNAの抽出方法は、時間がかかり、フェノール/クロロホルムプロトコル6または高価な列ベースのキット18のいずれかを使用して確立されています。潜在的に有害な化学物質の使用を回避するために、安価で、簡単で、フェノールを含まないDNA抽出方法を開発する傾向があります。マウス19およびゼブラフィッシュ20組織からのPCR品質のゲノムDNAを単離するためのプロトコルのこのタイプのホット水酸化ナトリウム及びトリス（ホットショット）を使用して確立されています。本研究では、変更された名手でDNAを得るためのプロトコルを提供し、日の細胞溶解物から直接で30ブタ胚を入力してPCRのセックス二重のプライマー対を再設計しました高精度。
Protocol
Representative Results
Discussion
ブタ胚のDNAセックスタイピングに関連する既存のプロトコルのほとんどは早期着床前段階15,16に適しています。我々が正常に妊娠後期の間、ブタ胚のスクリーニングに適したプロトコルを開発しました。以前の研究6,18からの胚の同様の発達段階での研究に基づき、本プロトコルは、安全で低コストであると考えられています。
このプロトコルは、96ウェ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
アルバータ州畜産食肉エージェンシー株式会社、豚肉CRC、アルバータ州の豚肉、Hypor Aヘンドリックス遺伝当社及びNSERC CRSNG：著者は協力し、以下の研究助成機関の財政的貢献を感謝したいです。
Materials
| KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit | KAPABiosystems | KR0370 | other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Life Technologies | S33102 | Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe |
| Pig female and male genomic DNA | Zyagen | GP-160-F1 & GP-160-M5 | Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used. |
| Typhoon FLA 9500 laser scanner | GE Healthcare Life Sciences | 28-9969-43 | other imaging system can be used |
| Free Soft Nitrile Examination Gloves | WWR | 89038-270 | any other examination glove can be used |
| Sodium hydroxide, solid | Fisher | BP 359 -212 | Molecular Biology Grade |
| Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean | Eppendorff | 0030 108.051 | heat resistant |
| ThermoStat plus | Eppendorff | 22670204 | Use as a incubator for 95C, don't need to use the heater |
| Toothpick | Bunzl Plc | 75200815 | Any round wooden toothpicks can be used – quality wood |
| Microcentrifuge 5417R/5417C | Eppendorff | 22621807 | This model was discontinued. But another newer model can be used |
| Microspatula | Fisher | SDI28540115 | Autoclaved before use each time. |
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