ورم في المخ / شريحة عضوي النمط المشارك ثقافة النظام لدراسة ورم المكروية والمستهدفة المخدرات العلاجات
Summary
Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice.
Abstract
Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.
Introduction
جعلت أبحاث السرطان مؤخرا التطورات الهامة في تحديد الطفرات الجينية، والتغيرات الجزيئية والعلاجات الممكنة لمجموعة متنوعة من أورام المخ. وعلى الرغم من هذا التقدم، لا تزال أورام المخ واحدة من الأسباب الرئيسية للوفيات المرتبطة بالسرطان للبالغين والأطفال. وتشمل العوامل التي تحد في مجال البحوث ورم في المخ القيود المفروضة على توفر عينات المريض الابتدائية وخطوط الخلايا وصعوبة في تكرار المكروية الدماغ فريدة من نوعها وغير المتجانسة في النظم التجريبية يمكن الوصول إليها. بالنسبة لكثير من أورام الدماغ الشروط المطلوبة للحفاظ على الخلايا السرطانية مع مرور الوقت ليست معروفة بعد. حتى لعلاج أورام المخ التي يمكن زراعتها في تعليق خلية كما neurospheres، وظروف ثقافة قد تؤثر على الخلايا السرطانية 1،2. في الواقع، فإن إضافة عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية أو عامل نمو البشرة لتشجيع انتشار وتمنع التمييز قد يغير التعبير الجيني 1. طرق أخرى لنمو الخلايا السرطانية من هذا القبيلكما نشر الورم في الفئران عن طريق طعم أجنبي مثلي أو تحت الجلد من الخلايا السرطانية هي فحوصات قيمة، ولكنها محدودة بسبب عوامل مثل الوقت من تطوير ورم (وخاصة بالنسبة للأورام درجة منخفضة)، والتكلفة، وعدد الخلايا السرطانية التي يمكن حقنها ودرس . الأساليب الحالية وبالتالي لخلايا ورم في الدماغ البشرية المتنامية غير كافية للحفاظ على أنواع الأورام معينة، وغالبا ما توفر بيئات اصطناعية التي لا تحاكي بشكل وثيق في الجسم الحي بيئات الورم.
أنواع متميزة من أورام الدماغ عند الأطفال تنمو في مواقع متخصصة للغاية داخل المخ [3، 4] وهذا من المرجح أن تعكس متطلبات microenvironmental متميزة لنمو الورم [5]. يصف هذا البروتوكول بوضع نظام جديد حيث الخلايا التي يصعب نشر في ظروف التربية العادية يمكن زراعتها في المكروية الدماغ عضوي النمط الذي يحاكي في ظروف نمو الورم الجسم الحي. في هذا الاختبار الكمي، fluorescently المسمىومطلي الخلايا السرطانية في الدماغ في الأحداث شرائح عضوي النمط مخ الفأر ومراقبتها مع مرور الوقت. هذا الاختبار يمكن أن تستخدم لدراسة تأثير المكروية على نمو الورم، واختبار علاجات دوائية جديدة في المكروية الدماغ ذات الصلة سريريا.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول كيف خلايا ورم في المخ يمكن fluorescently المسمى ومطلي على جزء الدماغ سهمي على فأرة الحاسوب P6 ثم مراقبة لمدة أسبوع واحد في الثقافة. ويمكن استخدام هذا ورم في المخ / عضوي النمط شريحة شارك في الثقافة الاختبار لتحديد تأثير المكروية الإقليمية على عدد الخلايا ال…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by grants from the NIH (P01CA142536 to RAS, T32CA009361 to DPY) and the Pediatric Low Grade Astrocytoma foundation.
Materials
| HEPES | Invitrogen | 17504044 | |||
| Glucose | Invitrogen | 17502048 | |||
| Pennicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |||
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |||
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |||
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |||
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |||
| Neurobasal-A- Medium minus phenol red | Invitrogen | 12349015 | |||
| Low Melting Point Agarose | Promega | V2111 | |||
| Slice Culture Inserts | Milipore | PICM0RG50 | |||
| laminin | Invitrogen | 23017015 | |||
| Cm-DiI | Invitrogen | V22888 | |||
| EDU (Labeling and Detection) | Life Technologies | c10337 | |||
| Microspheres | Life Technologies | F-21010 | |||
| Vibratome | Leica | N/A | |||
| Confocal Microscope | Nikon Eclipse Ni C2si | N/A | |||
| Image J software | N/A | N/A | |||
| 5mm Cover Glasses | Fisher Scientific | 64-0700 (CS-5R) | |||
References
- Heddleston, J. M., et al. Glioma stem cell maintenance: the role of the microenvironment. Curr Pharm Des. 17 (23), 2386-2401 (2013).
- Sasai, K. Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies. Cancer Res. 66 (8), 4215-4222 (2006).
- Louis, D. N., et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Acta Neuropathol. 114 (2), 97-109 (2007).
- Duffau, H., Capelle, L. Preferential brain locations of low-grade gliomas. Cancer. 100 (12), 2622-2626 (2004).
- Chourmouzi, D., et al. Manifestations of pilocytic astrocytoma: a pictorial review. Insights Imaging. 5 (3), 387-402 (2014).
- Buonamici, S., et al. Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma. Sci Transl Med. 2 (51), 51ra70 (2010).
- Choi, Y., Borghesani, P. R., Chan, J. A., Segal, R. A. Migration from a mitogenic niche promotes cell-cycle exit. J Neurosci. 25 (45), 10437-10445 (2005).
- Chan, J. A., et al. Proteoglycan interactions with Sonic Hedgehog specify mitogenic responses. Nat Neurosci. 12 (4), 409-417 (2009).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three- dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nat Commun. 6, 6220 (2015).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
