Et enkelt alternativ til Stereotactic Injection for Brain Spesifikk knockdown av miRNA
Summary
MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.
Introduction
MicroRNAs har dukket opp som nye terapeutiske mål på grunn av sin universelle rolle i regulering av genekspresjon og direkte bevis for engasjement i sykdom. Mirnas blir aktivt utforsket for sitt potensial som legemiddel rettet mot 1,2. Videre er endringer i miRNA uttrykk forbundet med flere sykdommer 3 og simulering av disse endringene ved kunstig forstyrrelse av miRNA uttrykk kan benyttes for å studere de cellulære veier som er involvert i sykdomsmanifestasjonen. Vevsspesifikk levering av miRNA rettet mot narkotika er i dag en stor utfordring for miRNA basert legemiddelutvikling. Antagomirs og miRNA etterligner er lovende agenter for perturbing miRNA nivåer 4-6. Imidlertid spesielle egenskaper som forbedrer deres spesifisitet og effekt må bli innlemmet i utformingen av antagomirs før de kan anvendes for in vivo forstyrrelse av miRNA uttrykk.
MicroRNAs er spesielt relevant som mål i dag uhelbredelig nevrodegenerativ og nevroutviklingsmessige sykdommer. Blod-hjerne-barrieren utgjør en hindring for levering av antagomirs i hjernen. Stereotaktisk injeksjon er mye brukt i gnagermodeller å levere molekyler til bestemte steder i hjernen 7. Det krever dyktighet, omfattende investeringer i instrumentering og tid. Stereotaktiske injeksjoner er invasiv, involverer kirurgi, føre til minst mindre skade, og er begrenset til lokal levering. Bruken av celle penetrerende peptider med en preferanse for målretting neuroner kan motvirke disse begrensningene, siden de kan leveres via trans-vaskulære ruten, men bryter blod-hjerne barrieren. Et slikt peptid avledet fra Rabies virus glykoprotein (RVG), ble tidligere brukt til å levere siRNA mot japansk encefalitt Virus i mus 8. Vi fant at bruk av peptid for antagomir levering, kan mirnas være effektivt slått ned i musen hjernen 9.
ontent "> Den andre store utfordringen miRNA knock-down oppstår fra den lille størrelsen på mirnas og tilstedeværelsen av nært beslektede sekvens isoformer. Vi tar eksempelet med MMU-Mir-29 familien som består av tre nært beslektede isoformer, Mir-29a , b og c. Antagomirs blir også generelt modifisert langs ryggraden for å øke deres stabilitet og gjøre dem motstandsdyktige mot angrep av nukleaser. Låst Nucleic Acids (LNAs) har en ytterligere fordel at de forbedrer termisk stabilitet og med føre til målet degradering over og utover sterisk hindring 10. Innføring modifikasjoner langs ryggraden kan være effektive, men kostbart. Vi har tidligere sett at modifikasjoner utover et optimalt antall, kan ikke ytterligere å øke effektiviteten. Utformingen av antagomir involverer derfor den optimale modifikasjon av antagomir.Til komplekse antagomir ikke-kovalent med neurotropisk peptid, et ladet hepta- til Nona-arginin extension brukes. D-Argininerester blir brukt siden de gi bedre stabilitet som de ikke er utsatt for spaltning av proteaser. Hepta- til nona-arginin strekninger fungere som effektive celle penetrerende midler, selv om de ikke gi celletype spesifisitet. Ved kovalent å knytte RVG peptidet til nona-arginin linker, en neurotropisk, celle penetrerende peptid ble dannet. De positivt ladede rester av peptidet interagere med den negativt ladede nukleinsyre ryggrad, for å danne komplekser. Disse kompleksene kan benyttes til effektivt å transfektere DNA eller RNA i dyrkede celler og in vivo i vev.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we demonstrate a widely accessible methodology to study the effects of miRNA modulation. Currently, most attempts at in vivo characterization of miRNA functions involve the creation of knockout mice or a transgenic that expresses a miRNA sponge. Most miRNAs, even the cell type specific ones are expressed in more than one organ. For instance, miRNAs initially thought to be specific to the hematopoietic system are also expressed in the brain, due to the presence of microglia. Thus even a cell type specifi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Souvik Maiti for help in designing the antagomirs. We also acknowledge Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey, and Bijay Pattnaik for their help with experimental methods. This work was funded by the Council of Scientific and Industrial Research (BSC0123). HS, MV and RR acknowledge fellowship from the Council of Scientific and Industrial Research, India. MAS acknowledge fellowship from the University Grants Commission, India.
Materials
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Other | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
- Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
- Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders. Current Genomics. 10, 154-168 (2009).
- Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications. Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).
- Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. The Promise of MicroRNA Replacement Therapy. Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3, 1-17 (2012).
- Trang, P., et al. Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice. Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).
- Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome. J Vis Exp. (76), e50170 (2013).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Roshan, R., et al. Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice. RNA. 20, 1287-1297 (2014).
- Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand. Biochimie. 47, 1218-1227 (2008).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).
- Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA). Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).
- Guyenet, S. J., et al. A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia. J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Bergen, J. M., Park, I. -. K., Horner, P. J., Pun, S. H. Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids. Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).
- Zou, L. -. L., Ma, J. -. L., Wang, T., Yang, T. -. B., Liu, C. -. B. Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System. Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).
- Hwang, D. W., et al. A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA. Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).
