MiRNA Beyin Özgül demonte için Stereotaktik Injection Basit Alternatif
Summary
MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.
Introduction
MikroRNA'lar, gen ekspresyonu ve hastalık dahil olmak için doğrudan kanıt düzenlenmesinde, evrensel rolüne yeni tedavi yaklaşımları olarak ortaya çıkmıştır. İlaç 1,2 hedef olarak MiRNA aktif olarak potansiyeli araştırılmaktadır. Dahası, miRNA ifade değişiklikler çeşitli hastalıkların 3 ve miRNA ifade yapay pertürbasyon bu değişikliklerin simülasyonu ile ilişkili hastalık tezahürü katılan hücresel yollar incelemek için kullanılabilir. MiRNA hedef ilaçların dokuya özgü dağıtım şu anda miRNA tabanlı ilaç gelişimi için önemli bir sorundur. Antagomirs ve miRNA taklit miRNA düzeyleri 4-6 perturbing için umut verici maddelerdir. Bununla birlikte, bunların özgüllük ve etkinliğini arttırmak vasıflar da MiRNA ekspresyonu in vivo olarak bir pertürbasyon için kullanılmadan önce antagomirs tasarımına dahil edilmesi gerekir.
MikroRNA'lar alakalı olan Şu anda tedavi edilemeyen nörodejeneratif ve nöro-gelişimsel hastalıklarda hedef olarak. Kan-beyin bariyeri beyindeki antagomirs teslim bir kısıtlama teşkil etmektedir. Stereotaksik enjeksiyonlar beyne 7 belirli yerlere molekülleri sağlamak için kemirgen modelleri kullanılmaktadır. Bu beceri, enstrümantasyon ve zamanla geniş yatırım gerektirir. Stereotaktik enjeksiyonları en azından ufak yaralanmalara neden, ameliyat dahil ve yerel teslimat sınırlıdır, invaziv bulunmaktadır. Hedefleme nöronlar için bir tercih hücre delici peptidler kullanımı trans-damar yoldan teslim edilebilir çünkü bu sınırlamaları karşı ancak kan beyin bariyerini ihlal edebilir. Kuduz virüsü glikoproteini (RVG) elde edilen bu tür bir peptid, daha önce farelerde 8 Japon Ensefaliti Virüs karşı siRNA teslim etmek için kullanılmıştır. Biz antagomir teslimat için peptid kullanarak, miRNA'lar etkin olarak fare beyninde 9 devrilen bulmuşlardır.
ontent "> miRNA ikinci büyük zorluk knock-down miRNA'lar küçük boyutu ve yakından ilişkili dizi izoformlarının varlığı ortaya çıkar. Biz üç yakından ilişkili izoformlannın oluşur-miR-29 MMU ailesi örnek almak, miR-29a Nükleik asitler (LNA'lar) bile termal stabilitesini arttırmak ve bir avantajı da kilitli, b ve c. Antagomirs ayrıca genel olarak stabiliteyi artırmak ve nükleazlar tarafından saldırılara karşı dirençli kılmak için omurgası boyunca modifiye edilir. üzerinde ve ötesinde bozunmasını hedef yol sterik engelleme 10. tüm omurga boyunca değişiklikler Tanıtımı etkili ama pahalı olabilir. Biz daha önce optimal sayıda ötesinde değişiklikler ayrıca etkinliğini artırmak olmayabilir gördük. antagomir tasarımı dolayısıyla antagomir optimal değişiklik içerir.Karmaşık için antagomir kovalent olmayan nona-arginin uzantısı nörotropik peptid, bir yüklü hepta kullanılır. D-ArgininOnlar proteazlar tarafından bölünmesi kolay olan olmadığında daha yüksek stabilite kazandırabilir yana kalıntıları kullanılır. Nona-arginin uzanıyor hepta- ve hücre tipine spesifısitesi olmayan, ancak verimli hücre nüfuz etkenler olarak hareket etmektedir. Kovalent nona-arginin linker, bir nörotropik, hücre delici peptid oluşturulan için RVG peptid bağlayarak. Peptidin pozitif yüklü tortuları, kompleksler oluşturmak için, negatif yüklü nükleik asit omurgasıyla ilişki kurar etkileşim. Bu kompleksler, etkili bir şekilde kültürlenmiş hücrelere ve dokulara de vivo olarak DNA veya RNA transfekte etmek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we demonstrate a widely accessible methodology to study the effects of miRNA modulation. Currently, most attempts at in vivo characterization of miRNA functions involve the creation of knockout mice or a transgenic that expresses a miRNA sponge. Most miRNAs, even the cell type specific ones are expressed in more than one organ. For instance, miRNAs initially thought to be specific to the hematopoietic system are also expressed in the brain, due to the presence of microglia. Thus even a cell type specifi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Souvik Maiti for help in designing the antagomirs. We also acknowledge Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey, and Bijay Pattnaik for their help with experimental methods. This work was funded by the Council of Scientific and Industrial Research (BSC0123). HS, MV and RR acknowledge fellowship from the Council of Scientific and Industrial Research, India. MAS acknowledge fellowship from the University Grants Commission, India.
Materials
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Other | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
- Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
- Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders. Current Genomics. 10, 154-168 (2009).
- Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications. Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).
- Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. The Promise of MicroRNA Replacement Therapy. Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3, 1-17 (2012).
- Trang, P., et al. Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice. Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).
- Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome. J Vis Exp. (76), e50170 (2013).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Roshan, R., et al. Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice. RNA. 20, 1287-1297 (2014).
- Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand. Biochimie. 47, 1218-1227 (2008).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).
- Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA). Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).
- Guyenet, S. J., et al. A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia. J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Bergen, J. M., Park, I. -. K., Horner, P. J., Pun, S. H. Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids. Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).
- Zou, L. -. L., Ma, J. -. L., Wang, T., Yang, T. -. B., Liu, C. -. B. Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System. Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).
- Hwang, D. W., et al. A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA. Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).
