sinalizado-Bigode Eyeblink condicionamento clássico em Ratos fixo-Cabeça
Summary
The preparation presented here for whisker-signaled eyeblink conditioning in head-fixed mice precisely stimulates specific whiskers while allowing mice to ambulate on a cylindrical treadmill. A whisker stimulation conditioned stimulus (CS) paired with a periorbital shock unconditioned stimulus (US) results in reliable associative learning on this apparatus.
Abstract
Eyeblink conditioning is a common paradigm for investigating the neural mechanisms underlying learning and memory. To better utilize the extensive repertoire of scientific techniques available to study learning and memory at the cellular level, it is ideal to have a stable cranial platform. Because mice do not readily tolerate restraint, they are usually trained while moving about freely in a chamber. Conditioned stimulus (CS) and unconditioned stimulus (US) information are delivered and eyeblink responses recorded via a tether connected to the mouse’s head. In the head-fixed apparatus presented here, mice are allowed to run as they desire while their heads are secured to facilitate experimentation. Reliable conditioning of the eyeblink response is obtained with this training apparatus, which allows for the delivery of whisker stimulation as the CS, a periorbital electrical shock as the US, and analysis of electromyographic (EMG) activity from the eyelid to detect blink responses.
Introduction
condicionado piscar de olhos é uma forma de condicionamento pavloviano e um sistema modelo para investigar os mecanismos neurais de aprendizagem associativa e memória. Tem sido investigada em várias espécies, incluindo humanos, coelhos, gatos, ratos e ratinhos. O paradigma envolve a apresentação de dois estímulos emparelhados: um estímulo neutro condicionado (CS; por exemplo, um tom, um flash de luz, ou a estimulação whisker), e um estímulo incondicionado saliente (US; por exemplo, um sopro de ar para o olho, ou choque periorbital). Os EUA provoca uma incondicionada, a resposta eyeblink reflexiva (ou seja, UR). Eventualmente, após várias apresentações do emparelhado CS-US, o sujeito aprende a associar o CS com os EUA. Essa aprendizagem se manifesta sob a forma de uma resposta condicionada (CR), um piscar de olhos provocada pelo CS sozinho que precede a apresentação de os EUA.
condicionado piscar de olhos, sob a forma de rastreamento inclui um intervalo livre de estímulo de poucos hmilissegundos undred que separa o CS e os EUA (Figura 1). Traço condicionado é uma forma de aprendizado declarativo, uma vez que requer consciência das contingências de estímulo 1. O intervalo temporal que requer o animal a manter um neural 'trace' do CS em regiões frontais do cérebro, como o hipocampo para que os EUA e a CS a associar-se 1-6. Juntamente com as regiões do cérebro anterior, o condicionamento é também dependente do cerebelo 7.
condicionado Eyeblink é, portanto, um paradigma útil para a investigação das múltiplas facetas da memória, incluindo a aquisição, consolidação e recuperação. Durante o condicionamento piscar de olhos, um grupo de animais de controlo é apresentada com estímulos desemparelhados por ordem aleatória para testar pseudoconditioning ou sensibilizados respostas ao CS que podem ser causadas por apresentação só nos EUA, em vez de uma associação aprendido CS-US.
Um appara utilizadatus para a investigação de condicionamento de piscar de roedores é uma câmara em que os roedores estão autorizados a circular livremente durante o processo de formação 8-10. Com este tipo de dispositivo, um cabo é normalmente ligado a um capacete que está afixado ao crânio do roedor. A corda permite a entrega de os EUA (e por vezes, a CS) e para transmitir a resposta do animal aos estímulos (ou seja, a resposta de piscar) 10. O cabo pode ele próprio ser modificado com base no tipo de estímulos entregues e como a resposta eyeblink é gravado.
A razão para usar "livremente em movimento" ratos amarrados para o condicionamento eyeblink é que os ratos lutar contra contenção. Apesar de outras espécies podem ser mais receptivos a contenção, a grande vantagem de usar ratinhos em experimentos de condicionamento eyeblink é que a maioria das estirpes mutantes geneticamente modificados estão disponíveis estirpes de ratinho. Além lutam, res completostraint de ratos resulta em sofrimento agudo. Uma preparação rato fixo-cabeça que minimiza o stress aumentaria a informação fisiológica que pode ser obtida durante o condicionamento piscar de olhos. Por exemplo, este sistema permitiria imagens de neurônios corticais com microscopia de dois fótons de 11.
Preparações fixo de cabeça têm sido usados em experiências anteriores para imagiologia óptica do córtex através de implantes cranianos removíveis, in vivo registos electrofisiolicos do cérebro de roedores com matrizes tetrode, imagem de cálcio de dois fotões, e também como uma plataforma para o condicionamento de piscar de ratinhos 11 -16.
No sistema fixo-cabeça, estimulação e gravações de confiança são assegurados sem restrição completa do mouse (Figura 2). Um capacete como o usado no sistema movendo-se livremente é afixada ao crânio do mouse. Durante o treinamento, o capacete é afixada a um conector que está ligado a bares maisuma esteira cilíndrica, a fim de estabilizar a cabeça do roedor (Figura 2A). A esteira cilíndrica permite que o mouse para descansar confortavelmente, mas se o mouse assim o desejar, também permite que ele seja executado ou a andar. Com a utilização deste sistema, os ratos podem ser formados com uma vibração suiça como o CS e um choque eléctrico suave periorbital como os EUA (Figura 1). Os EUA é entregue através de fios cirurgicamente colocado debaixo da pele lateral, para o olho. O CS é entregue através de um pente que é ligado a um actuador 2-camada flexão rectangular (Figura 2B). O pente e flexão do actuador são, então, ligado a uma base magnética que é movido para a posição adequada durante o treino, e é ajustada para entrega ideal para cada animal individual. O pente está posicionada para escarranchar os bigodes selecionados. Durante a entrega do CS, é enviado um sinal para o actuador de flexão que desloca o pente e leva a vibração dos bigodes 17.
<p class= "jove_content"> Outros estímulos, como um tom ou um flash de luz têm sido usados como estímulos condicionados eficazes em camundongos no passado 16,18,19. A estimulação suiça razão é escolhida para o CS neste paradigma experimental, é a dependência de animais de murino na sua vibrissas para a entrada de informação somatossensorial durante a exploração. Estimulação suiça foi demonstrado ser um fiável e eficaz CS 20. Além disso, dado o substrato cortical bem estabelecida e organizada do sistema vibrissae (ou seja, o córtex barril), a estimulação suiça como o CS fornece uma ferramenta elegante para mapear alterações corticais e plasticidade associados com a aprendizagem eyeblink condicionado 20,21. Um sistema fixo-cabeça permite a estimulação precisa de bigodes selecionados para comparar as respostas entre os neurônios e neurônios que recebem entradas de bigodes não estimuladas estimuladas. Finalmente, muitas linhagens de camundongos apresentam perda auditiva relacionada à idade como adultos relativamente jovens <sup> 22, e fechamento das pálpebras durante o piscar condicionado altera a CS visual (embora um CS visuais faz melhorar questões com respostas de sobressalto 16). suiça estimulação não é afectada por qualquer uma destas complicações.Aqui apresentados são modificações únicas e importantes sobre outras preparações fixo-cabeça para o condicionamento piscar de olhos, incluindo métodos de entrega CS e US, bem como a aquisição da resposta eyeblink. A confiabilidade deste aparelho eo paradigma de formação no condicionamento eyeblink é demonstrado pelas curvas de ratos condicionados e uma curva de aprendizagem relativamente plana de animais de controle pseudoconditioned (Figura 7A) de aprendizagem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Classical eyeblink condicionado é uma forma de aprendizagem associativa que é uma ferramenta útil para a compreensão das bases neurais subjacentes à aprendizagem e memória. Os métodos anteriores empregues para o condicionamento de piscar de roedores, tais como ratinhos envolveu uma câmara que permitiu que o animal se mover livremente. A preparação fixa-cabeça para o condicionamento de piscar de ratinhos, usando o aparelho descrito por Chettih et ai. E Heiney et ai., E utilizados mais recente…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Defesa (W81XWH-13-01-0243) e os Institutos Nacionais de Saúde (R37 AG008796). Agradecemos Alan Baker em oficina mecânica da Universidade Northwestern para a construção do aparelho de cilindro fixo-cabeça. Agradecemos ao Dr. Shoai Hattori por sua orientação em MATLAB e Solidworks. Agradecemos ao Dr. John Power para o software LabView que controlava o experimento.
Materials
| Exervo TeraNova Foam Roller 36" x 6" | Amazon | B002ONUM0E | For cylinder |
| Plexiglas | Custom-made; 1 cm thick | ||
| Metal Rods (12.7mm diameter) | Custom-made | ||
| 4-40 machine screw (.25 in long) | Amazon Supply | B00F33Q8QO | For cylinder |
| Classic Design Hair Comb | Conair | 93505WG-320 | For whisker stimulation |
| 2-Layer Rectangular Bending Actuator | Piezo Systems | T220-A4-303X | For whisker stimulation |
| Solder and Flux Kit | Piezo Systems | MSF-003-NI | For whisker stimulation |
| Magnetic Base | Thor Labs | MB175 | For whisker stimulation |
| Threaded rod for magnetic base | Custom-made | ||
| Strips based on 221 series nylon strip connectors from Electronic Connector Corp. | Custom-made, based on Weiss and Disterhoft, 2008 | ||
| TO-220 Style Transistor | Amazon Supply | B0002ZPZYO | For connector; for the wings |
| Relia-Tac Sockets | Electronic Connector Corp. | 220-S02 | For connector |
| Relia-Tac Pins | Electronic Connector Corp. | 220-P02 | For headpiece |
| 0-80 stainless steel machine screw (1 in. long) | Amazon Supply | B000FN68EE | Locking Screw |
| 0-80 stainless steel machine screw hex nut (5/32 in. thick) | Amazon Supply | B000N2TK7Y | Locking Screw Head |
| Loctite Super Glue-Liquid | Loctite | 1365896 | Cyanoacrylic glue; for the locking screw |
| Quick Setting Epoxy | Ace Hardware | 18613 | For connector and whisker stimulation system |
| Ethernet Cable Wires | Ethernet cable can be taken apart to use the individual wires for the connector | ||
| Polyimide coated stainless steel wires (2 in. long, .005 in. diameter) | PlasticsOne | 005sw/2.0 37365 S-S | For headpiece, EMG and shock wires |
| Stainless steel uncoated wire (.005 in. diameter) | AM Systems | 792800 | For headpiece, ground wires |
| Tenma Variable Autotransformer | Tenma | 72-110 | For the whisker stimulation; rheostat to adjust current to the bending actuator |
| Amplifier | A-M Systems | 1700 | Amplifier for filtering and amplifying EMG signals |
| WPI A385R stimulus isolator | World Precision Instruments | 31405 | For the electrical shock |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein: Animal Health | 50031 | For surgery; anesthesia |
| Buprenex Injectable CIII | Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc | NDC 12496-0757-1 | For surgery; analgesic |
| Akwa Tears: Lubricant Ophthalmic Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | Artificial tear ointment to prevent dry eyes while under anesthesia |
| Povidine-Iodine Prep Pads | PDI | NDC 10819-3883-1 | For surgery; antiseptic |
| Alcohol Prep Pads | May be purchased from any standard pharmacy | ||
| Stainless steel surgical scalpel handles (no.3) | Integra Miltex | 4-7. | For surgery |
| Stainless steel surgical scalpel blades | Integra Miltex | 4-310 or 4-315 | For surgery; number 10 or 15 scalpel blade |
| 3% Hydrogen Peroxide | May be purchased from any standard pharmacy | ||
| Micro Clip | Roboz | RS-5459 | For surgery, to hold back skin |
| 00-90 stainless steel machine screw (0.0625 in. long) | Amazon Supply | B002SG89X4 | For surgery, to wrap ground wire around |
| Professional Rotary Tool | Walnut Hollow | 29637 | Hand drill for surgery, to drill holes in skull |
| Inverted Cone Burr | Roboz | RS-6282C-34 | Inverted cone burr size 34; for surgery, to drill holes in skull |
| Engraving Cutter Drill Bit | Dremel | 106 | Engraving cutter; 1.6 mm bit; for surgery, to drill holes in skull |
| C&B Metabond-Quick! Cement System "B" Quick Base | Parkell | S398 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System Clear L-Powder | Parkell | S399 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System "C" Universal TBB Catalyst 0.7 ml | Parkell | S371 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System Ceramic Mixing Dish with temperature strip | Parkell | S387 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| Swiss Tweezers, style #5 | World Precision Instruments | 504506 | For surgery |
| Puritan Cotton-Tipped Applicators | VWR International | 10806-005 | For surgery |
| Dental Caulk Grip Cement Kit | Dentsply | 675570 | For surgery; dental cement |
References
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