Whisker-signalisierte Eyeblink Klassische Konditionierung in Head-Fest Mäuse
Summary
The preparation presented here for whisker-signaled eyeblink conditioning in head-fixed mice precisely stimulates specific whiskers while allowing mice to ambulate on a cylindrical treadmill. A whisker stimulation conditioned stimulus (CS) paired with a periorbital shock unconditioned stimulus (US) results in reliable associative learning on this apparatus.
Abstract
Eyeblink conditioning is a common paradigm for investigating the neural mechanisms underlying learning and memory. To better utilize the extensive repertoire of scientific techniques available to study learning and memory at the cellular level, it is ideal to have a stable cranial platform. Because mice do not readily tolerate restraint, they are usually trained while moving about freely in a chamber. Conditioned stimulus (CS) and unconditioned stimulus (US) information are delivered and eyeblink responses recorded via a tether connected to the mouse’s head. In the head-fixed apparatus presented here, mice are allowed to run as they desire while their heads are secured to facilitate experimentation. Reliable conditioning of the eyeblink response is obtained with this training apparatus, which allows for the delivery of whisker stimulation as the CS, a periorbital electrical shock as the US, and analysis of electromyographic (EMG) activity from the eyelid to detect blink responses.
Introduction
Eyeblink Anlage ist eine Form der Pawlowschen Konditionierung und ein Modellsystem für die neuronalen Mechanismen des assoziativen Lernens und des Gedächtnisses zu untersuchen. Es wurde in verschiedenen Arten, einschließlich Menschen, Kaninchen, Katzen, Ratten und Mäusen untersucht. Das Paradigma beinhaltet die Präsentation von zwei gepaarte Reize: ein neutrales konditionierten Reiz (CS, zB einen Ton, einen Lichtblitz oder Whisker Stimulation) und einen ausgeprägten unbedingten Reiz (US, zB ein Luftstoß auf das Auge, oder periorbitalen Schock). Die US entlockt einen unbedingten, reflexive eyeblink Reaktion (dh UR). Schließlich, nach mehreren Präsentationen des gekoppelten CS-US, lernt das Subjekt die CS mit den USA zu verbinden. Dieses Lernen manifestiert sich in Form einer konditionierte Reaktion (CR), ein von der CS ausgelöst eyeblink allein, die die Präsentation der US vorausgeht.
Eyeblink Anlage in der Spur Form enthält einen Stimulus freien Intervall von wenigen Stundenundred Millisekunden, die die CS und die USA (Abbildung 1) trennt. Trace Anlage ist eine Form der deklarativen Lernen , da es das Bewusstsein für die Stimulus Eventualitäten erfordert 1. Die zeitliche Lücke erfordert das Tier ein neuronales 'Spur' zu halten , der CS in forebrain Regionen wie dem Hippocampus , um für die USA und die CS 1-6 assoziiert werden. Zusammen mit den Vorderhirns Regionen ist Trace Anlage auch abhängig von dem Cerebellum 7.
Eyeblink Anlage ist daher ein nützliches Paradigma für die Untersuchung der zahlreichen Facetten des Gedächtnisses, einschließlich des Erwerbs, Konsolidierung und Abruf. Während eyeblink Anlage, eine Kontrollgruppe von Tieren mit ungepaarten Stimuli in zufälliger Reihenfolge präsentiert für pseudoconditioning oder sensibilisierte Reaktionen auf die CS zu testen, die durch US-Präsentation verursacht werden können, allein und nicht als CS-US-Verband gelernt.
Eine häufig verwendete Apparatus für die Untersuchung von eyeblink Anlage bei Nagern ist eine Kammer , in der die Nagetiere sind erlaubt 8-10 über frei während des Trainingsprozesses zu bewegen. Mit dieser Art von Vorrichtung wird ein Tether normalerweise an einem Kopfstück befestigt ist, die an das Nagetier Schädel befestigt ist. Der Haltegurt ermöglicht die Abgabe der US (und manchmal auch die CS) und für das Tier die Antwort auf diese Stimuli zu übertragen (dh die eyeblink response) 10. Das Fangband selbst kann basierend auf der Art von Stimuli modifiziert werden, geliefert und wie die eyeblink Antwort wird aufgezeichnet.
Der Grund für die "frei bewegen" tethered Mäuse für eyeblink Anlage ist, dass Mäuse gegen Zurückhaltung zu kämpfen. Obwohl andere Spezies Rückhalte zugänglicher sein kann, ist der Hauptvorteil von Mäusen in eyeblink Konditionierungsversuche mit, dass die Mehrzahl der verfügbaren genetisch veränderten Mutanten-Stämme Mausstämme sind. Zusätzlich zu kämpfen, komplett resTraint von Mäusen führt zu einer akuten Notlage. Ein Kopf-Fest Maus Vorbereitung, die Stress minimiert würde die physiologischen Informationen erhöhen, die während der eyeblink Anlage erhalten werden können. Zum Beispiel würde dieses System Imaging von kortikalen Neuronen ermöglichen , mit 2-Photonen Mikroskopie 11.
Head-feste Präparate wurden in früheren Experimenten zur optischen Abbildung des Kortex durch entfernbare kranialen Implantate in vivo elektrophysiologische Aufnahmen des Nagetier Gehirn mit Tetrode Arrays, Zwei-Photonen – Calcium – Bildgebung, und auch als Plattform für eyeblink Anlage in Mäusen 11 -16.
Im Kopf festen System, zuverlässige Stimulation und Aufnahmen werden ohne vollständige Zurückhaltung der Maus (Abbildung 2) gewährleistet. Ein Kopfstück, wie die in der frei beweglichen System verwendet wird, um die Maus des Schädels befestigt. Während des Trainings wird das Kopfstück an einem Verbinder befestigt, die an Stangen befestigt ist, überein zylindrisches Laufband, um die Rattenkopf (2A) zu stabilisieren. Der zylindrische Laufband kann die Maus bequem zur Ruhe, aber wenn die Maus dies wünscht, kann es auch zu laufen oder zu gehen. Mit der Verwendung dieses Systems, Mäuse mit einer whisker Vibration als CS und einer milden periorbital elektrischen Schlag als US (Figur 1) ausgebildet. Die USA wird über Drähte geliefert chirurgisch unter der Haut seitlich auf das Auge gelegt. Die CS ist über einen Kamm geliefert, die zu einer 2-Schicht rechteckigen Biegeaktor (2B) angebracht ist. Der Kamm und Biegeaktor werden dann einer Magnetbasis befestigt, die an der richtigen Position während des Trainings bewegt wird, und ist für eine optimale Abgabe für jedes einzelne Tier angepasst. Der Kamm ist so positioniert, um die ausgewählten Whisker spreizen. Während der Abgabe des CS, wird ein Signal an den Biegestellglied gesendet , die den Kamm und führt zu einer Vibration der Whisker 17 verdrängt.
<p class= "jove_content"> andere Reize wie einen Ton oder ein Lichtblitz haben so effektiv konditionierten Stimuli bei Mäusen in der Vergangenheit 16,18,19 verwendet. Der Grund, Whisker Stimulation wird in diesem experimentellen Paradigma für die CS gewählt ist die Abhängigkeit von murinen Tiere auf ihre Tasthaare für somatosensorischen Informationseingabe während der Exploration. Whisker Stimulation wurde eine zuverlässige und effektive CS – 20 gezeigt werden. Darüber hinaus die gut etablierte und organisierte Rindensubstrat des vibrissae System (dh der Barrel Cortex), Whisker Stimulation gegeben , wie die CS für die Abbildung kortikalen Veränderungen und Plastizität mit dem Lernen eyeblink Anlage 20,21 zugeordnet ist ein elegantes Werkzeug zur Verfügung stellt. Ein Kopf-Fest System ermöglicht die präzise Stimulation ausgewählter Whiskers Antworten zwischen stimulierten Neuronen und Neuronen empfangen Eingaben von nicht-stimulierten Whiskers zu vergleichen. Schließlich viele Stämme von Mäusen zeigen altersbedingten Hörverlust als relativ junge Erwachsene <sup> 22, und Lidschluss während der konditionierten blink ändert eine visuelle CS (obwohl eine visuelle CS Fragen tut verbessern mit Schreckreaktionen 16). Whisker Stimulation wird nicht durch eine dieser Komplikationen betroffen.Präsentiert hier sind einzigartige und wichtige Änderungen auf andere kopffesten Vorbereitungen für eyeblink Anlage, einschließlich der Methoden für CS und US-Lieferung, und der Erwerb der eyeblink Antwort. Die Zuverlässigkeit dieser Geräte und die Ausbildung Paradigma in eyeblink Anlage wird durch Lernkurven von konditionierten Mäusen und einer relativ flachen Lernkurve von pseudoconditioned Kontrolltieren (7A) unter Beweis gestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Klassische eyeblink Anlage ist eine Form des assoziativen Lernens, das ist ein nützliches Werkzeug für das Verständnis der neuronalen Substrate zugrunde liegenden Lernen und Gedächtnis. Frühere Verfahren zur eyeblink Anlage bei Nagetieren eingesetzt wie Mäuse eine Kammer beteiligt, die für das Tier erlaubt, sich frei zu bewegen. Ein Kopf-Fest Vorbereitung für eyeblink Anlage in Mäusen, wobei die Vorrichtung von Chettih beschriebenen et al. Und Heiney et al. Und zuletzt verwendeten in Licht-evo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das Department of Defense (W81XWH-13-01-0243) und die National Institutes of Health (R37 AG008796) gefördert. Wir danken Alan Baker in der Northwestern University Maschinenhalle für den Bau des kopffesten Zylindervorrichtung. Wir danken Dr. Shoai Hattori für seine Führung in MATLAB und Solidworks. Wir danken Dr. John Power für die LabView-Software, die das Experiment gesteuert.
Materials
| Exervo TeraNova Foam Roller 36" x 6" | Amazon | B002ONUM0E | For cylinder |
| Plexiglas | Custom-made; 1 cm thick | ||
| Metal Rods (12.7mm diameter) | Custom-made | ||
| 4-40 machine screw (.25 in long) | Amazon Supply | B00F33Q8QO | For cylinder |
| Classic Design Hair Comb | Conair | 93505WG-320 | For whisker stimulation |
| 2-Layer Rectangular Bending Actuator | Piezo Systems | T220-A4-303X | For whisker stimulation |
| Solder and Flux Kit | Piezo Systems | MSF-003-NI | For whisker stimulation |
| Magnetic Base | Thor Labs | MB175 | For whisker stimulation |
| Threaded rod for magnetic base | Custom-made | ||
| Strips based on 221 series nylon strip connectors from Electronic Connector Corp. | Custom-made, based on Weiss and Disterhoft, 2008 | ||
| TO-220 Style Transistor | Amazon Supply | B0002ZPZYO | For connector; for the wings |
| Relia-Tac Sockets | Electronic Connector Corp. | 220-S02 | For connector |
| Relia-Tac Pins | Electronic Connector Corp. | 220-P02 | For headpiece |
| 0-80 stainless steel machine screw (1 in. long) | Amazon Supply | B000FN68EE | Locking Screw |
| 0-80 stainless steel machine screw hex nut (5/32 in. thick) | Amazon Supply | B000N2TK7Y | Locking Screw Head |
| Loctite Super Glue-Liquid | Loctite | 1365896 | Cyanoacrylic glue; for the locking screw |
| Quick Setting Epoxy | Ace Hardware | 18613 | For connector and whisker stimulation system |
| Ethernet Cable Wires | Ethernet cable can be taken apart to use the individual wires for the connector | ||
| Polyimide coated stainless steel wires (2 in. long, .005 in. diameter) | PlasticsOne | 005sw/2.0 37365 S-S | For headpiece, EMG and shock wires |
| Stainless steel uncoated wire (.005 in. diameter) | AM Systems | 792800 | For headpiece, ground wires |
| Tenma Variable Autotransformer | Tenma | 72-110 | For the whisker stimulation; rheostat to adjust current to the bending actuator |
| Amplifier | A-M Systems | 1700 | Amplifier for filtering and amplifying EMG signals |
| WPI A385R stimulus isolator | World Precision Instruments | 31405 | For the electrical shock |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein: Animal Health | 50031 | For surgery; anesthesia |
| Buprenex Injectable CIII | Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc | NDC 12496-0757-1 | For surgery; analgesic |
| Akwa Tears: Lubricant Ophthalmic Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | Artificial tear ointment to prevent dry eyes while under anesthesia |
| Povidine-Iodine Prep Pads | PDI | NDC 10819-3883-1 | For surgery; antiseptic |
| Alcohol Prep Pads | May be purchased from any standard pharmacy | ||
| Stainless steel surgical scalpel handles (no.3) | Integra Miltex | 4-7. | For surgery |
| Stainless steel surgical scalpel blades | Integra Miltex | 4-310 or 4-315 | For surgery; number 10 or 15 scalpel blade |
| 3% Hydrogen Peroxide | May be purchased from any standard pharmacy | ||
| Micro Clip | Roboz | RS-5459 | For surgery, to hold back skin |
| 00-90 stainless steel machine screw (0.0625 in. long) | Amazon Supply | B002SG89X4 | For surgery, to wrap ground wire around |
| Professional Rotary Tool | Walnut Hollow | 29637 | Hand drill for surgery, to drill holes in skull |
| Inverted Cone Burr | Roboz | RS-6282C-34 | Inverted cone burr size 34; for surgery, to drill holes in skull |
| Engraving Cutter Drill Bit | Dremel | 106 | Engraving cutter; 1.6 mm bit; for surgery, to drill holes in skull |
| C&B Metabond-Quick! Cement System "B" Quick Base | Parkell | S398 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System Clear L-Powder | Parkell | S399 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System "C" Universal TBB Catalyst 0.7 ml | Parkell | S371 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System Ceramic Mixing Dish with temperature strip | Parkell | S387 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| Swiss Tweezers, style #5 | World Precision Instruments | 504506 | For surgery |
| Puritan Cotton-Tipped Applicators | VWR International | 10806-005 | For surgery |
| Dental Caulk Grip Cement Kit | Dentsply | 675570 | For surgery; dental cement |
References
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