Den bm12 Induserbare Modell av systemisk lupus erythematosus (SLE) i C57BL / 6 Mus

Summary

The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.

Abstract

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.

Introduction

Systemisk lupus erythematosus (SLE) er en kompleks autoimmun sykdom karakterisert prototypically av anti-nuclear antistoff (ANA) produksjon og glomerulonefritt. En rekke andre følgesykdommer, inkludert dermal, hjerte-lunge, og lever lesjoner er assosiert med sykdom hos noen individer. Prevalensestimater i USA varierer mye, fra 150,000-1,500,000 ^1,2, med spesielt høy forekomst hos kvinner og minoriteter ^3. Selv om etiologien av SLE har vært vanskelig å skjelne, er det tenkt å oppstå fra samspillet mellom ulike genetiske og miljømessige faktorer, som kulminerer i systemisk autoimmunitet.

Mange dyremodeller har blitt ansatt for å studere faktorer som fører til sykdomsutbruddet og progresjon. Klassiske musemodeller av SLE inkludere genetisk predisponerte musestammer inkludert NZB x NZW F1-modellen og dens derivater, NZM MLR / lpr-stamme, og den BXSB / Yaa belastning, og induserbare systemer, slik som p-ristane og kronisk graft-versus-host-sykdom (cGVHD) modeller ^4. Tidlige rapporter om autoantistoff produksjon i GVHD modeller brukt ulike musestammer eller hamster stammer for foreldre til F1 overføringer ^{5 – 8;} vanligste metodene som brukes for å studere lupus-lignende sykdom for tiden omfatter DBA / to foreldre → (C57BL / 6 x DBA / 2) F1, og bm12 overføring modellen beskrevet her. Hver modell har sine egne begrensninger, men de vanligvis har et felles sett med funksjoner som korrelerer med kliniske sykdom hos mennesker. De oftest rapporterte parametre i musemodeller inkluderer splenomegali, lymfadenopati, nefritt, ANA produksjon, og på cellenivå, utvidelse av T follikulære hjelpeceller (TFH), germinale sentrum (GC) B-celler og plasmaceller.

Den induserbare bm12 modellen oppnås ved adoptiv overføring av lymfocytter fra IA ^bm12 B6 (C) – H2 – Ab1 ^bm12 / KhEgJ (bm12) mus, en stamme identical til C57BL / 6 med unntak av 3 aminosyresubstitusjoner på MHC klasse II, i IA ^b C57BL / 6 (B6) mus. Alloactivation av donor CD4 T-celler hos mottakeren APC fører til cGVHD med symptomer som likner SLE. Nærmere bestemt, disse inkluderer ekspansjon av donor-avledede TFH, utvidelse av mottaker GC-avledede B-celler og plasmaceller, og produksjon av ANAS inkludert anti-dsDNA, anti-ssDNA, anti-kromatin, og anti-RBC-antistoffer ^9. Over tid resipientmus utvikle glomerulonefritt assosiert med IgG innskudd i glomerulær, interstitiell og vaskulære regioner i nyrene ^10. Vi har nylig vist at, i likhet med human sykdom, er det også en avgjørende rolle for type I-IFN i denne modellen ^11. Spesielt, de definerende kriterier for human SLE ​​inkluderer utvikling av nefritt forenlig med SLE i nærvær av anti-dsDNA-antistoffer ^12, som begge er fremtredende trekk ved denne musemodell.

Det er i seg selvVeral fordeler ved bm12 modellen i løpet av de spontane modeller. Classic-modellene som utvikler SLE-lignende tegn spontant stole på enten hybridmusestammer, innavlede musestammer ikke på B6 bakgrunn, eller store genetiske loci på B6 bakgrunn, som gjør krysset til knockout eller på annen måte genmodifiserte mus vanskelig og tidkrevende. Med bm12 induserbare modellen, kan genetisk modifiserte mus tjener som enten donor eller mottaker, slik at mer rask identifisering av den cellulære rommet i hvilket bestemte gener kan være viktig for sykdom. Videre er sykdomsutvikling i bm12 modellen mye raskere, krever bare to uker til utseendet ANAS, sammenlignet med flere måneder for de spontane modeller. Videre, i motsetning til de spontane modeller som utvikler sykdom ved forskjellige tidspunkter, sykdomsutbruddet og progresjon i bm12 → B6 modellen er meget synkronisert. Dette åpner for generering av riktig størrelse årskull som kan be brukt for intervensjons eller terapeutiske strategier på ethvert stadium i sykdomsutviklingen.

Det følgende er en detaljert protokoll for å initiere SLE-lignende autoimmunitet ved adoptiv overføring av bm12 lymfocytter inn i C57BL / 6-mus, eller genetiske varianter på B6 bakgrunn. I tillegg, beskriver vi en strømningscytometrisk fargeprotokoll for opplisting TFH, GC-B-celler og plasmaceller-celletyper assosiert med human sykdom. Viktigere, kan disse protokollene også brukes til å karakterisere sykdom i de fleste musemodeller av SLE og identifisere TFH, GC-B-celler og plasmaceller i andre sykdomsmodeller.

Protocol

Animal arbeidet ble utført under patogenfrie forhold i henhold til retningslinjer fastsatt av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International og vår Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). MERK: Innarbeide mus som uttrykker en congenic markør som CD45.1 på hver giver eller mottaker dyr hvis mulig, fordi dette åpner for overvåking av donor pode effektivitet og spesifikk utvidelse av donor CD4 T-cellepopulasjon. Hvis de vurderer bruk av e…

Representative Results

Syke mus utvikler splenomegaly i så lite som 14 dager, viser spleens 2-3 ganger størrelsen av sunn mus i form av masse og cellularity (figur 2). Splenocytter sekvensielt inngjerdet på lysspredning (FSC-A ved SSC-A), eliminering av dubletter (FSC-W eller -H av FSC-A), levedyktige celler (lav farging av levedyktighet fargestoff), og CD4 + TCRβ + (figur 3A). Donorceller skiller seg fra mottakerceller basert på CD45.1 og CD45.2 <strong…

Discussion

Den bm12 induserbare modellen er en forholdsvis enkel og effektiv måte å studere de molekylære og cellulære prosesser av SLE. Kronisk aktivering av adoptivt overført CD4 T-celler rettet mot selvantigener fører til akkumulering av TFH, GC-B-celler og plasmaceller som kan bli målt ved strømningscytometri, som beskrevet her. Fremtidige studier ved hjelp av denne modellen kan raskt og enkelt avhøre rolle kandidat gener og nye behandlingsformer i autoimmune germinale midt prosesser som ligner de som forekommer hos p…

Materials

B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ	The Jackson Laboratory	001162	CD45.1+ BoyJ mouse strain
B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ	The Jackson Laboratory	001162	Bm12 mouse strain
FastDigest PsuI	Life Technologies	FD1554	Restriction digest enzyme for genotyping
1X RBC Lysis Buffer	eBioscience	00-4333-57
IMDM	GE Healthcare	SH30228.01
Plasma Separation Tube (PST)	BD	365974	Blood collection tube with Dipotassium EDTA
Serum Separation Tube (SST)	BD	365967	Blood collection tube with Clot activator / SST Gel
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	High density cell separation solution
Lympholyte-M	Cedarlane	CL5030	High density cell separation solution
GL-7-biotin	eBioscience	13-5902-82
Streptavidin-BUV395	BD	564176
CD138-BV421	BioLegend	142508
CD4-BV510	BioLegend	100559
TCRβ-BV605	BD	562840
CD45.1-BV711	BioLegend	110739
CD45.2-FITC	BioLegend	109806
PD-1-PE	BioLegend	135206
CD19-PerCP	BioLegend	115532
Fas-PE-Cy7	BD	557653
CXCR5-APC	BioLegend	145506
Fixable Viability Dye ef780	eBioscience	65-0865-18
CD4-BV421	BioLegend	100443
1.2 ml FACS tube inserts, racked	USA Scientific	1412-1400
BD Falcon™ Round-Bottom Tubes	BD	352017