Forberedelse og Photoacoustic Analyse af Cellular køretøjer indeholdende guld nanorods

Summary

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Abstract

Guld nanorods er attraktive for en række biomedicinske anvendelser, såsom photothermal ablation og Photoacoustic billeddannelse af cancer, takket være deres intense optisk absorbans i det nærinfrarøde vindue, lav cytotoksicitet og potentiale til hjem i tumorer. Men deres levering til tumorer stadig et problem. En innovativ tilgang består i udnyttelsen af tropisme af tumor-associerede makrofager, som kan belastes med guld nanorods in vitro. Her beskriver vi udarbejdelse og Photoacoustic inspektion af cellulære køretøjer, der indeholder guld nanorods. PEGylerede guld nanorods modificeres med kvaternære ammoniumforbindelser, for at opnå et kationisk profil. Ved kontakt med murine makrofager i almindelige petriskåle, er disse partikler viser sig at undergå massiv optagelse i endocytiske vesikler. Så disse celler er indlejret i biopolymere hydrogeler, der anvendes til at verificere, at stabiliteten af ​​Photoacoustic konverteringaf partiklerne tilbageholdes i deres inklusion i cellulære køretøjer. Vi er overbeviste om, at disse resultater kan give ny inspiration til udvikling af nye strategier til at levere plasmoniske partikler til tumorer.

Introduction

Gennem det seneste årti har forskellige plasmoniske partikler, såsom guld nanorods, nanoshells og nanocages, fået stor opmærksomhed til applikationer i biomedicinsk optik ^{1, 2, 3, 4.} I strid med standard guld nanosfærer, disse nyere partikler genlyd i det nærinfrarøde (NIR) vindue, der giver dybeste optiske penetration gennem kroppen og højeste optiske kontrast løbet endogene komponenter ^1. Denne funktion har vakt interesse for innovative applikationer, såsom Photoacoustic (PA) billedbehandling og photothermal ablation af kræft. Men en række spørgsmål begrænse den kliniske indtrængning af disse partikler. For eksempel deres optiske aktivering tendens til at inducere deres overophedning og ændre deres funktionelle udformninger mod flere sfæriske profiler, som styrer en photoinstability ^{5, 6, 7, 8} </^{sup>, 9.} Et andet spørgsmål, der dominerer den videnskabelige debat er deres systemisk levering i tumorer. Især guld nanorods kombinere størrelser, der er ideel til at gennemsyre tumorer, der viser øget permeabilitet og fastholdelse og nem konjugation med specifikke prober af maligne markører. Derfor er deres forberedelse til en direkte injektion i blodstrømmen opfattes som en mulig ordning ^{10, 11, 12, 13.} Men denne rute stadig problematisk, idet de fleste af partiklerne bliver fanget af det mononukleære fagocytsystem ^{10, 11, 12.} Derudover anden bekymring er den optiske og biokemiske stabilitet af partiklerne efter cirkulation gennem kroppen ^14. Når partiklerne mister deres kolloid stabilitet og aggregat, kan deres plasmoniske funktioner og varmeoverførsel dynamik lider plasmoniske kobling ^15, </sop> ^{16, 17} og cross-overophedning ^18.

På det seneste er begrebet at udnytte tropisme af tumorassocierede makrofager dukket op som et smart alternativ ^{19, 20, 21.} Disse celler holde en medfødt evne til at opdage og gennemsyre tumorer med høj specificitet. Derfor kan ét perspektiv være at isolere disse celler fra en patient, indlæse dem med guld nanorods in vitro og derefter injicere dem tilbage i patienten, med den hensigt at bruge dem som cellulære køretøjer med ansvar for leverancen. En anden fordel ville være at få mere kontrol over den optiske og biokemiske stabilitet af partiklerne, fordi deres biologiske grænseflade ville være konstrueret in vitro. Stadig, opførelser af disse cellulære køretøjer som optiske kontrastmidler har brug for en kritisk analyse.

I dette arbejde, vi beskriver fremstilling og kritiske spørgsmål af cellular køretøjer, der indeholder guld nanorods for PA billeddannelse af kræft. PEGylerede guld nanorods er modificeret med kvarternære ammoniumforbindelser ^22, for at opnå et kationisk profil, der forventes at fremme deres interaktion med plasmatiske membraner ^{23, 24.} Disse partikler gennemgår effektiv og uspecifik optagelse fra de fleste cellulære slags, forhåbentlig uden at forstyrre meget med deres biologiske funktioner. Murine makrofager er fyldt med op til så mange som 200, 000 kationiske guld nanorods per celle, som bliver begrænset inden for stramme endocytiske vesikler. Denne konfiguration skulle opstå bekymring på grund af truslen om plasmoniske kobling og på tværs af overophedning inde i disse vesikler. Derfor er makrofagerne indlejret i biopolymere hydrogeler, der efterligner biologiske væv, for at verificere, at de fleste af stabiliteten af ​​PA omdannelse af partiklerne tilbageholdes i overførslen fra vækstmediet til de endocytiske vesikler. Effective målekriterier er udarbejdet med henblik på at måle stabiliteten af ​​PA konvertering under forhold af umiddelbar interesse for PA billeddannelse. En omforme tærsklen er fastsat til den meget indtræden af ​​optisk ustabilitet efter et tog på 50 laserpulser med den typiske gentagelseshastighed på 10 Hz.

Vi er overbeviste om, at disse resultater kan give momentum for udvikling af nye strategier til at levere plasmoniske partikler til tumorer.

Protocol

Bemærk: Alle koncentrationer af guld nanorods er udtrykt i nominelle Au molariteter. Til sammenligning med andre værker, opmærksom på, at en M Au nogenlunde svarer til 20 uM guld nanorods, i vores tilfælde. 1. Forberedelse af kationiske Gold nanorods Bemærk: Fremgangsmåden begynder med syntesen af cetrimoniumbromid (CTAB) -capped guld nanorods af den autokatalytiske reduktion af HAuCl 4 med ascorbinsyre, ifølge protokollen indført ved Nikoobakht…

Representative Results

Her er muligheden for cellulære køretøjer, der indeholder guld nanorods for PA billeddannelse af kræft vist sammen med typiske resultater af protokollen. TEM-billeder i figur 1 viser den sædvanlige udseende af partiklerne efter trin 1 og deres cellulære køretøjer efter trin 2. Fremstillingen af partiklerne og af cellerne for TEM billeddannelse er beskrevet andetsteds 17. Kationiske guld nano…

Discussion

Begrebet at målrette tumor-associerede makrofager fremstår som et stærkt koncept for kræftbekæmpelse ^{34, 35, 36.} Her, i stedet for deres ødelæggelse, er disse celler rekrutteres som cellulære køretøjer til at bringe guld nanorods i en tumor, ved udnyttelse af deres tropisme. Dette perspektiv kræver en tankevækkende design af partiklerne, deres integration i cellerne og deres karakterisering. Vi har fundet, at fotostabilitet af murine makrofager ladet med…

Materials

Hexadecyltrimethylammonium bromide	Sigma-Aldrich	H6269	To synthesize gold nanorods
Gold(III) chloride trihydrate	Sigma-Aldrich	520918	To synthesize gold nanorods
Silver nitrate	Sigma-Aldrich	S6506	To synthesize gold nanorods
L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960	To synthesize gold nanorods
Sodium borohydride	Sigma-Aldrich		To synthesize gold nanoseeds
MeO-PEG-SH	Iris Biotech	PEG1171	To PEGylate gold nanorods. Molecular weight about 5,000 Da
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099	To PEGylate gold nanorods and solubilize chitosan
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S8750	To PEGylate gold nanorods
(11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide	Sigma-Aldrich	733305	To modify gold nanorods with quaternary ammonium compounds
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	276855	To solubilize (11-mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide
Polysorbate 20	Sigma-Aldrich	P2287	To centrifuge PEGylated gold nanorods
PBS	Lonza	BE17-516F	To suspend gold nanorods before incubation with cells and to treat pellets of cells
J774a.1	ATCC	TIB-67	Monocyte/macrophage murine cell line
DMEM	Lonza	BE12-707F	Cell culture medium
FBS	Lonza	DE14-801F	To be added to cell culture medium
L-glutamine	Lonza	BE17-605E	To be added to cell culture medium
Penicillin/streptomycin	Lonza	DE17-602E	To be added to cell culture medium
Petri dish	NEST	705001	Cell culture dish
Cell scraper	EuroClone	ES7018	To detach cells
Formaldehyde	Fluka	47630	To fix cells
Chitosan, low molecular weight	Sigma-Aldrich	448869	75-85% deacetylated. Molecular weight about 120,000 Da
Sodium hydroxyde	Sigma-Aldrich	306576	To insolubilize chitosan and generate the hydrogel
Polystyrene cell culture plates	NEST	702011	Used as molds to fabricate chitosan hydrogels
Optical parametric oscillator pumped by the third harmonic of a Q-switched Nd:YAG laser	Continuum, Santa Clara, USA	Surelite OPO plus	Source of optical excitation for photoacoustic tests
Pyroelectric detector	Gentec, Quebec, Canada	QE8SP	To monitor optical fluence for photoacoustic tests
Pre amplified needle hydrophone	Precision Acoustic, Dorset, UK	Model with 1 mm sensor diameter and 1-20 MHz frequency range	To measure photoacoustic signals