Hemodinâmica Caracterização de roedores modelos de Hipertensão Arterial Pulmonar

Summary

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a disease of pulmonary arterioles that leads to their obliteration and the development of right ventricular failure. Rodent models of PAH are critical in understanding the pathophysiology of PAH. Here we demonstrate hemodynamic characterization, with right heart catheterization and echocardiography, in the mouse and rat.

Abstract

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare disease of the pulmonary vasculature characterized by endothelial cell apoptosis, smooth muscle proliferation and obliteration of pulmonary arterioles. This in turn results in right ventricular (RV) failure, with significant morbidity and mortality. Rodent models of PAH, in the mouse and the rat, are important for understanding the pathophysiology underlying this rare disease. Notably, different models of PAH may be associated with different degrees of pulmonary hypertension, RV hypertrophy and RV failure. Therefore, a complete hemodynamic characterization of mice and rats with PAH is critical in determining the effects of drugs or genetic modifications on the disease.

Here we demonstrate standard procedures for assessment of right ventricular function and hemodynamics in both rat and mouse PAH models. Echocardiography is useful in determining RV function in rats, although obtaining standard views of the right ventricle is challenging in the awake mouse. Access for right heart catheterization is obtained by the internal jugular vein in closed-chest mice and rats. Pressures can be measured using polyethylene tubing with a fluid pressure transducer or a miniature micromanometer pressure catheter. Pressure-volume loop analysis can be performed in the open chest. After obtaining hemodynamics, the rodent is euthanized. The heart can be dissected to separate the RV free wall from the left ventricle (LV) and septum, allowing an assessment of RV hypertrophy using the Fulton index (RV/(LV+S)). Then samples can be harvested from the heart, lungs and other tissues as needed.

Introduction

A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença da vasculatura pulmonar associada a infiltração de células inflamatórias, a proliferação do músculo liso e a apoptose de células endoteliais. Estas alterações resultam em obliteração das arteríolas pulmonares, posteriormente, levando à ventrículo direito (RV) disfunção e insuficiência cardíaca. A fim de compreender a fisiopatologia subjacente PAH e falência do VD na HAP, um número de diferentes modelos, incluindo modelos genéticos e farmacológicos, para estudar esta doença têm sido desenvolvidos (revisto em outros lugares ^1,2).

Destes modelos, os mais populares são (Hx) HAP induzida por hipoxia no mouse ea monocrotalina (MCT) e modelos SU5416-hipoxia (SuHx) no rato. No modelo de rato Hx, os ratinhos são expostos a 4 semanas de hipóxia (quer normobáricas ou hipobárica, o que corresponde a uma altitude de 18.000 pés com uma FiO2 de 0,10), com o desenvolvimento resultante de proliferação medial, o aumento da RV Systpressões Olic e o desenvolvimento de hipertrofia do VD ^3. MCT numa dose única de 60 mg / kg resulta em lesão para as células endoteliais pulmonares através de um mecanismo claro que, em seguida, resulta no desenvolvimento de HAP ^4. SU5416 é um inibidor dos receptores vasculares factor de crescimento endotelial (VEGFR) 1 e 2 bloqueador, e o tratamento com uma única injecção subcutânea de 60 mg / kg, seguida de exposição a hipoxia crónica durante 3 semanas resulta em hipertensão pulmonar permanente com alterações patológicas similares à observada na doença humana, com a formação de lesões vasculares obliterante ^5. Nos últimos anos, diversos modelos de ratinho transgénicos para a hipertensão pulmonar tem sido desenvolvido. Estes incluem nocaute e mutações do receptor de proteína morfogenética óssea 2 (BMPR2), como mutações genéticas BMPR2 são encontrados em ambas as formas familiares e idiopática da HAP, heme oxigenase-1 nocaute e IL-6 superexpressão (revisto em outros lugares ^1,2).

Estes modelos de roedores diferentes de PH têm diferentes níveis de hipertensão pulmonar, hipertrofia RV e falência do VD. Enquanto a hipóxia e vários modelos de camundongos transgênicos resultar em PAH muito mais suave do que a qualquer modelo de rato ^1, permite que testes de diferentes mutações genéticas e suas vias de sinalização molecular associados. O modelo MCT não resultar na HAP grave, embora MCT parece ser tóxico para as células endoteliais em diversos tecidos ^4. O modelo SuHx é caracterizada por alterações vasculares mais semelhante ao observado em HAP idiopática em seres humanos, embora tanto a exposição requer manipulação e hipóxia farmacológico. Além disso, em todos estes modelos, pode haver uma separação entre as alterações histopatológicas, as pressões pulmonares e função do VD associados com o desenvolvimento de hipertensão arterial pulmonar. Isto está em contraste com a doença humana, onde há normalmente uma relação proporcional entre as alterações histopatológicas, a gravidade da pulmonhipertensão ary e do grau de falência do VD. Assim, uma caracterização detalhada destes modelos de roedores de PH é necessária, e envolve avaliações da função RV (tipicamente por ecocardiografia), hemodinâmica (por cateterismo cardíaco) e histopatologia do coração e pulmões (de colheita de tecidos).

Neste protocolo, descrevemos as técnicas básicas usadas para a caracterização hemodinâmica de modelos de HAP no rato e do rato. Estas técnicas gerais pode ser aplicado a qualquer estudo do ventrículo direito e vasculatura pulmonar e não está limitado aos modelos de HAP. Visualizando o RV por ecocardiografia é relativamente simples em ratos, mas é mais desafiador em camundongos devido ao seu tamanho e da geometria complexa da RV. Além disso, alguns substitutos utilizados para quantificar a função do VD, como TAPSE, artéria pulmonar (AP) tempo de aceleração e PA Doppler onda chan, não são bem validadas em humanos e correlacionar apenas fracamente com a avaliação de puhipertensão lmonary e função RV por hemodinâmica invasiva. Determinação dos hemodinâmica RV é o melhor feito com um de tórax fechado, para manter os efeitos de uma pressão negativa intratorácica com a inspiração, embora cateterismo peito aberto com um cateter de impedância permite a determinação da pressão-volume (PV) loops e uma caracterização hemodinâmica mais detalhada . Como com qualquer procedimento, desenvolver a experiência com os procedimentos é fundamental para o sucesso experimental.

Protocol

Todos os procedimentos descritos seguir as orientações de cuidados de animais de Duke University School of Medicine. 1. Antes de iniciar o procedimento Nota: Antes de quaisquer procedimentos com animais, garantir que a permissão institucional adequado foi obtido. Tal como acontece com todos os procedimentos, usar medicação para a dor adequado para garantir que não há sofrimento animal. cateteres nivelada com solução salina estéril heparinizad…

Representative Results

Como cateterismo cardíaco direito em roedores é tipicamente um procedimento terminal que não é aplicável ao acompanhamento longitudinal, a ecocardiografia é uma excelente alternativa não invasiva para o rastreio e seguimento 12. Enquanto a pressão sistólica da artéria pulmonar em PAH humana no ecocardiograma geralmente é derivada de insuficiência tricúspide que normalmente é fácil de ser obtido na vista apical, tal visão não é obtido de forma confiável em roedores, impedindo que a estimativ…

Discussion

The protocols outlined here describe a comprehensive characterization of hemodynamics and right ventricular function in rodent models of pulmonary hypertension. While right heart catheterization as described here is a terminal procedure, the mortality associated with echocardiography is minimal, which allows for screening and follow-up of disease progression. However, similar to patients with PH having markedly increased mortality with anesthesia¹⁷, in our experience, rats with severe PH do not tolerate anesth…

Materials

Vevo 2100 Imaging System (120V)	VisualSonics, inc.	VS-11945
Vevo 2100 Imaging Station	VisualSonics, inc.
High-frequency Mechanical Transducers	VisualSonics, inc.	MS250, MS550D, MS400
Ultrasound Gel Parker	Laboratories Inc.	01-08
PowerLab 4/35	ADInstruments	ML765
Labchart 8	ADInstruments
BP transducer with stopcock and cable	ADInstruments	MLT1199
BP transducer calibration kit	ADInstruments	MLA1052
Mikro-Tip Pressure Catheter for mouse	Millar	SPR-1000	Alternative catheter available from Scisense FT111B (mouse) and FT211B (rat)
Mikro-Tip Pressure Catheter for rat	Millar	SPR-513	Alternative catheter available from Scisense FT111B (mouse) and FT211B (rat)
Millar Mikro-Tip ultra-miniature PV loop catheter for mice	Millar	PVR-1035	Alternative catheter available from Scisense FT112 (mouse)
Millar Mikro-Tip ultra miniature PV loop catheter for rats	Millar	SPR-869	Alternative catheter available from Scisense FT112 (mouse)
Millar PV system MPVS-300	Millar	MPVS-300
4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool	Roboz Surgical	SUT-15-2
6-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool	Roboz Surgical	SUT-14-1
Iris Scissors, Delicate, Integra Miltex	VWR	21909-248
VWR Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip	VWR	82027-588
VWR Delicate Scissors, 4 1/2"	VWR	82027-582
Two star Hemostats, Excelta	VWR	63042-090
Neutral-buffered formalin	VWR	89370-094
Crotaline	Sigma	C2401
SU5416	Tocris Biosciences	3037
3.5X-45X Boom Stand Trinocular Zoom Stereo Microscope	AmScope	SM-3BX
PE (Polyethylene Tubing)-10	Braintree Scientific Inc	PE10 36 FT
PE (Polyethylene Tubing)-50	Braintree Scientific Inc	PE50 36 FT
PE (Polyethylene Tubing)-60	Braintree Scientific Inc	PE60 36 FT
Tabletop Isoflurane Anesthesia Unit	Kent Scientific	ACV-1205S
Surgisuite multi-functional surgical platform	Kent Scientific	Surgisuite
Retractor set	Kent Scientific	SURGI-5002
Anesthesia induction chamber	VetEquip	941443
Anesthesia Gas filter canister	Kent Scientific	ACV-2001
Rodent nose cone	VetEquip	921431