Electrotaxis Studier av lungekreft celler ved hjelp av en Multichannel Dual-elektrisk-felt microfluidic Chip
Summary
Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.
Abstract
Oppførselen til retningscellemigrering under en likestrøms-elektrisk felt (DCEF) er referert til som electrotaxis. Den betydelige rolle fysiologiske DCEF i guiding celle bevegelse i løpet av embryo utvikling, celledifferensiering og sårtilheling har blitt vist i mange studier. Ved å anvende microfluidic chips til en electrotaxis analysen blir undersøkelsesprosessen forkortes og eksperimentelle feil er minimalisert. I de senere år microfluidic anordninger laget av polymere substanser (for eksempel polymetylmetakrylat, PMMA, eller akryl) eller polydimetylsiloksan (PDMS) har blitt mye brukt i å studere reaksjoner i cellene til elektrisk stimulering. Men i motsetning til de mange trinnene som kreves for å dikte opp en PDMS enhet, enkel og rask bygging av akryl mikro fl uidic chip gjør den egnet for både enheten prototyping og produksjon. Men ingen av de rapporterte enheter lette effektiv studie av samtidig kjemisk og DCEF virkninger på celler. I denne rapporten beskriver vi vår design og fabrikasjon av en akrylbasert flerkanals dual-elektrisk-feltet (MDF) chip for å undersøke samtidige effekten av kjemisk og elektrisk stimulering på lungekreft celler. MDF-brikken har åtte kombinasjoner av elektriske / kjemiske stimuleringer i en enkelt test. Brikken ikke bare sterkt forkorter den nødvendige eksperimentelle tid, men også øker nøyaktigheten i electrotaxis studier.
Introduction
Oppførselen til adherente celler beveger seg mot en anode eller katode i henhold til en likestrøm-elektrisk felt (DCEF) er referert til som electrotaxis. Den electrotactic oppførsel av celler spiller en betydelig rolle i embryogenese, nerve regenerering, og sårheling. 1 Tumorceller som rotteprostatakreftceller, à brystcancerceller, 3 og lunge adenokarsinomceller 4-8 har vist electrotactic bevegelse under en påført DCEF . Den fysiologiske EF har blitt målt i kjertel vev. 9,10 Electrotaxis er også blitt rapportert i kjertel-assosiert tumorceller. 2,3 Tatt sammen, electrotaxis kreftceller er ansett å være en metastase faktor. 11 Styre elektriske veiledning kreftceller under DCEF kan være en mulig tilnærming for fremtidig behandling av kreft. Men i dag, den detaljerte molekylære mekanismen for electrotaxis fortsatt kontroversielt. Derfor en undersøkelse av influence av elektrisk stimulering på kreft celle migrasjon kan bidra til utvikling av strategier for kreftbehandling.
Nylig har bio-microfluidic enheter blitt fabrikkert for å studere cellulære responser til å flyte skjærkraft, 12 kjemiske gradienter, 13 og elektrisk stimuli 4 in vitro. Fabrikasjon av bio-microfluidic enheter ved hjelp polydimethylsiloxane (PDMS) eller polymethylmethacrylate (PMMA, også kjent som akryl) har fått redusert strykprosent av slike eksperimenter. Videre bruker akrylbasert microfluidic enheter som en prototype for å undersøke biologiske fag er enklere enn å bruke PDMS chips. Ulike funksjoner i akryl-baserte enheter har blitt utviklet for electrotaxis studien. Imidlertid har ingen av de tidligere utførelser er i stand til samtidig å teste effekten av forskjellige kjemiske forhold og det elektriske felt på celler for electrotaxis studien. Derfor har vi utviklet en microfluidic enhet-multichannel dual-elektrisk-feltet (MDF) chip som inneholder fire uavhengige kulturkanaler og åtte ulike eksperimentelle forhold i en chip.
Den akrylbaserte MDF chip, først rapportert av Hou et al., 8 integreres elektrisk stimulering og flere kjemisk isolerte kanaler. Kan brukes Disse kjemisk isolerte kanaler til kulturen forskjellige typer av celler i en eksperiment. Den DCEF i kanalene frembringes ved hjelp av en elektrisk kraftforsyning. To uavhengige elektriske felt, ett med anvendt elektrisk feltstyrke (EFS) og en annen med 0 EFS, er gjennomført i hver kjemisk isolert kanal. På denne måten gir den bedre chip-kontrollerte sameksistens EF og kjemisk stimulering. Videre resultater fra numerisk simulering av kjemisk diffusjon inne i MDF chip tyder på at ingen krysskontaminering skjedde mellom kanalene etter en 24 timers forsøksperioden. 8
Sammenlignet med device beskrevet av Li et al., gir 14 MDF-brikken et større område kultur, som gir mulighet for ytterligere biokjemiske analyse av de elektrisk stimulerte celler. I tillegg, med MDF brikkens større observasjonsområde, flere celler kan observeres i testen, slik at analysen av migrasjonshastigheten eller directedness av de elektrisk stimulerte celler er mer nøyaktig. De enkanals chip-design av tidligere studier rapportert av Huang et al. 4 og Tsai et al. 15 tillater bare en type celle eller kjemisk for å bli testet. Imidlertid kan MDF brikken bli brukt til å undersøke effektene av forskjellige kjemikalier på electrotaxis, samt virkningene av elektrisk stimulering på forskjellige typer celler. Med andre ord tillater den MDF chip for effektiv studiet av kjemiske doseavhengigheter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi fant prosessen med å følge akryl adaptere på Layer 1 av MDF chip for å være vanskelig. Anvendelsen av bare 1 til 2 mL av superlim er tilstrekkelig til fast følge adapteren på MDF chip. Større mengder lim resulterte i en ufullstendig polymerisasjon av superlim og unnlatelse av å følge. Når akryl adaptere ble godt festet på MDF chip, sjelden skjedde væskelekkasje i microfluidic system. I tillegg O / N inkubasjon inne i vakuumkammeret bidratt til å fjerne luft fanget mellom dobbeltsidig tape / cover glass …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is financially supported by the Ministry of Science and Technology, Taiwan (Contract no. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) and the Research Program on Nanoscience and Nanotechnology, Academia Sinica, Taiwan.
Materials
| Reagent | |||
| DMEM medium | Gibco,Invitrogen, USA | 12800-017 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco,Invitrogen, USA | 16000-044 | |
| Trypsin | Gibco,Invitrogen, USA | 25200-072 | |
| PBS | Basic Life | BL2651 | |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical Co | 10005583 | |
| agarose | LONZO, USA | SeaKem LE AGAROSE | |
| syringe | Terumo | 3 ml with Luer taper | |
| 3-way stopcock | Nipro | with Luer taper | |
| PMMA (acrylic) | HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan | thickness 1mm, 2mm | |
| acrylic adaptor | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | 1/4-28 port, 10x10x6 mm | customized |
| nut | Thermo Fisher Scientific Inc. | UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x | |
| Microscope cover glass | Deckgläser, Germany | 24×60 mm | |
| double-sided tape | 3M | PET 8018 | |
| super glue | 3M | Scotch Liquid Plus Super Glue | |
| Teflon tube | HENG YI ENTERPRISE CO., LTD., Taiwan | UPTB_06, DUPONT TEFLON BRAND RESIN FEP TUBING | outer diameter 1/16 in., inner diameter 0.03 in.; Upchurch Scientific |
| TFD4 detergent | Franklab, France | TFD4 | |
| ultrasonic steri cleaner | LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan | ||
| Thermo bonder | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | customized | |
| CO2 laser scriber | LTT group, Taiwan | ISL-II | |
| indium tin oxide glass (ITO glass) | AimCore Technology Co., Ltd | TN/STN, ≦10Ω | |
| proportional-integral-derivative (PID) controller | JETEC Electronics Co., Japen | TTM-J40-R-AB, | |
| K-type thermocouple | TECPEL | TPK-02A | |
| 4-channel syringe pump | KdScientific, USA | 250P | |
| DC power supply | GWInstek, Taiwan | ||
| X-Y-Z motor stage | TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan | customized | |
| inverted microscope | Olympus, Japan | CKX41 | |
| digital SLR camera | Canon, Japan | 60D |
References
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Djamgoz, M. B. A., Mycielska, M., Madeja, Z., Fraser, S. P., Korohoda, W. Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric field: involvement of voltagegated Na+ channel activity. J Cell Sci. 114, 2697-2705 (2001).
- Pu, J., et al. EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells. J Cell Sci. 120, 3395-3403 (2007).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6, e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, 14102-1410214 (2012).
- Tsai, H. F., et al. Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation. PLoS One. 8, e73418 (2013).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, (2014).
- Faupel, M., et al. Electropotential evaluation as a new technique for diagnosing breast lesions. Eur J Radiol. 24, 33-38 (1997).
- Szatkowski, M., Mycielska, M., Knowles, R., Kho, A. L., Djamgoz, M. B. Electrophysiological recordings from the rat prostate gland in vitro: identified single-cell and transepithelial (lumen) potentials. BJU Int. 86, 1068-1075 (2000).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. J Cell Sci. 122, 4267-4276 (2009).
- Das, T., Maiti, T. K., Chakraborty, S. Traction force microscopy on-chip: shear deformation of fibroblast cells. Lab Chip. 8, 1308-1318 (2008).
- Lin, F., Butcher, E. C. T cell chemotaxis in a simple microfluidic device. Lab Chip. 6, 1462-1469 (2006).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensors and Actuators B: Chemical. 99, 186-196 (2004).
- Chu, Y. W., et al. Selection of invasive and metastatic subpopulations from a human lung adenocarcinoma cell line. Am J Respir Cell Mol Biol. 17, 353-360 (1997).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, 24105 (2008).
- Cheng, J. -. Y., Yen, M. -. H., Hsu, W. -. C., Jhang, J. -. H., Young, T. -. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17, 2316 (2007).
- Pu, J., Zhao, M. Golgi polarization in a strong electric field. J Cell Sci. 118, 1117-1128 (2005).
- Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. J Cell Sci. 117, 397-405 (2004).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C., Zhao, M. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J Cell Physiol. 216, 527-535 (2008).
