Ympning av pärlor att utveckla kycklingembryo Limbs att identifiera signaltransduktionsvägar som påverkar Gene Expression

Summary

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Abstract

Använda kycklingembryon är det möjligt att direkt testa effekterna av antingen tillväxtfaktorer eller specifika inhibitorer av signalvägar på genuttryck och aktivering av signaltransduktionsvägar. Denna teknik medger avgivning av signalmolekyler vid exakt definierade utvecklingsstadier för specifika tider. Efter denna embryon kan skördas och genexpression undersöks, till exempel genom hybridisering in situ, eller aktivering av signaltransduktionsvägar som observeras med immunfärgning.

I den här videon heparin pärlor indränkt i FGF18 eller AG 1-X2 pärlor indränkt i U0126, en MEK-hämmare, är ympade in lemmen bud in ovo. Detta visar att FGF18 inducerar uttryck av MyoD och ERK fosforylering och både endogen och FGF18 inducerad MyoD uttryck hämmas av U0126. Pärlor indränkt i en retinoinsyra antagonist kan förstärka tidig MyoD induktion av FGF18.

Detta tillvägagångssätt kan vara ossed med ett brett utbud av olika tillväxtfaktorer och inhibitorer och lätt anpassas till andra vävnader i det växande embryot.

Introduction

Fågelembryon har gett ett kraftfullt verktyg för att studera utveckling i många år ^1. En av deras mest användbara egenskaper är att de är relativt lätta att manipulera. Extern utveckling är det möjligt att öppna ägget att komma åt embryot och utföra olika micromanipulations inklusive exempel som den klassiska vaktel-chick chimär system för att studera cell öde ^2,3, injektion av retrovirus för överuttryck i specifika vävnader under utveckling ^4,5 och Explantation kultur att identifiera utvecklingssignalkällor ^6. På senare tid Chimärer genereras mellan omärkta värdar med transplantat från en transgen kyckling som uttrycker GFP har visat att kombinationen av klassisk ympning och genetisk modifiering kan ge viktiga insikter i utvecklings ^7,8.

Den lätthet med vilken fågelembryo kan manipuleras har gjort den till en utmärkt modell för att studera lemutveckling ^9. Tillämpning av särskilda tillväxtfaktorer för att utveckla ben in vivo har varit avgörande för att identifiera faktorer som förändrar lem mönstring ^10,11 och fortsätter att ge insikter i denna process ^12. Detta tillvägagångssätt har också använts för att studera de faktorer som reglerar muskelutveckling och har avslöjat roller för många signaler såsom Wnts ^13, BMP ¹⁴ och HGF ^15.

Nyligen denna teknik har använts för att undersöka de signaler som styr myogenic genuttryck i extremiteten linda och har visat att interaktioner mellan FGF18 och retinoinsyra kan styra tidpunkten för MyoD uttryck ^16. Med en kombination av tillväxtfaktorer och små molekyler som kan lastas på pärlor och sedan ympade direkt till specifika vävnader vid definierade utvecklingsstadier ger möjlighet att ingripa nästan när som helst och regionen under utveckling. Detta har använts för att investigate många processer inklusive somit mönstring ^17,18, neural specifikation ^19, neurallist migration ²⁰ och axel förlängning ^21.

Här beskriver vi en metod för ympning pärlor indränkt i antingen tillväxtfaktorer eller inhibitorer till att utveckla kyckling lemmar. Detta har använts för att bestämma effekterna av dessa signaler på myogenes genom att analysera muskler specifikt genuttryck med in situ hybridisering. Vi beskriver transplantat med användning av antingen heparin dränkts pärlor, som används för tillväxtfaktorer eller AG 1-X2 pärlor för små hydrofoba molekyler, såsom retinsyra eller små molekylhämmare av specifika signalvägar. Men andra pärlor är också tillgängliga som har använts för att leverera både FGF ²² och Shh ^23.

Protocol

Etik uttalande: Alla dessa experiment följer djuromsorg och etiska riktlinjer vid universitetet i Nottingham. 1. Framställning av Heparin Pärlor för Ympning Tvätta heparin pärlor noggrant i PBS före användning. Anm: Pärlor kan lagras vid 4 ° C som en uppslamning i PBS. Välj pärlor för ympning genom att ta bort dem från lager med en 20 l pipett i en 1 ml droppe PBS. Använd sedan en mikropipett inställd på 2 | j, l för att överföra pärl…

Representative Results

På HH stadium 21 MyoD inte uttrycks i att utveckla lem myoblaster fastän färgning kan ses i myotome av utvecklings somiter (Figur 1A). Figur 1B visar in situ-hybridisering för MyoD 6 timmar efter en FGF18 vulst transplantatet. MyoD induceras i myoblaster nära pärlan medan det inte finns något uttryck i kontralaterala. Co-ympning av en kula indränkt i U0126, en specifik hämmare av MEK, blockerar FGF18 induktion av MyoD (Figur 1C). Likaså ympning en U01…

Discussion

Användningen av pärla transplantat appliceras direkt till att utveckla vävnader in ovo är ett kraftfullt verktyg för att dissekera roll tillväxtfaktorsignalering under utveckling som ger oöverträffad kontroll över utvecklingsstadium där de tillämpas och exponeringstiden.

Valet av vulsten för varje typ av molekyl är viktig. Små hydrofoba molekyler, såsom inhibitorer beskrivs här och retinsyra, oftast binder väl till derivatiserad AG 1-X2 pärlor även om det är nödvändigt …

Materials

Heparin acrylic beads	Sigma	H5263	The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads,
AG 1-X2 beads	Bio-Rad	140-1231
Affi Gel blue beads	Bio-Rad	153-7301; 153-7302	These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads
FGF18	Peprotech	100-28	Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose.
U0126	Cell Signalling	9903	Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
BMS-493	Tocris Biosciences	3509	Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
Black Indian ink	Windsor and Newton	5012572003384 (30ml)	While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos
Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95%	Alfa Aesar	10404
Penicillin / streptomycin	Sigma	P0781	Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS