This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.
The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain’s global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.
光遺伝学機能的磁気共鳴イメージング(ofMRI)は、細胞型特異的な機能の神経回路のマッピング全体を横切ってそのダイナミクスを可能にする光遺伝学刺激1-11,38の精度で高磁場のfMRIの空間分解能を組み合わせた新規な技術であります脳。光遺伝学は、オプシンと呼ばれる感光性膜貫通コンダクタンスチャネルの導入によって、刺激のために標的とされる特定の細胞タイプを可能にします。神経回路の具体的な要素は、遺伝学的に無傷の脳1-15活動のミリ秒タイムスケール変調を可能にする、これらのチャネルを発現するように改変されます。 fMRIのは、神経活動の間接的な測定を提供する血液酸素レベル依存(BOLD)信号16-18、を測定することにより、特定の神経回路の光遺伝学的刺激に対する脳のグローバルな動的応答を決定するための非侵襲的方法を提供します。
それは比較的高い空間分解能で脳全体のビューを提供することができるので、これら二つの技術の組み合わせは、光遺伝学機能的磁気共鳴イメージング(ofMRI)と呼ばれる、そのような電気生理学などの刺激の間に脳活動を記録する他の方法よりも有利です。これは、侵襲的記録電極1-11の注入を必要とせずに刺激のサイトからの偉大な距離で標的刺激に応答した神経活動を検出することができます。 ofMRIは、電極近傍の異なる種類の細胞を動員し、したがって、各集団19の因果影響を混乱することができfMRIの中に電気刺激を行うのより伝統的な方法で、より有利で す。また、電極は、電気刺激のために使用され、生成された電流は、MRイメージング20中にアーチファクトを生成することができます。実際、ofMRIは、特定のmodulatiからグローバル脳活動への影響の観察が可能そのようなトランスジェニック動物でのCre-Lox系またはプロモーターの使用などの高度な遺伝子標的化技術の使用を介して様々な細胞型の上に。全脳モニタリングとコンビナトリアル光制御は、特定の細胞型を励起するために阻害しにChR2する両方NpHRの使用を通じてofMRIで可能です。 ofMRIで使用可能な光遺伝学ツールキットも急速に増加し、光感度または改善されたキネティクスと、安定化ステップ関数のオプシン(SSFOs)の、または移植繊維の必要性を否定することが赤色にシフトオプシンのオプシンの導入に時間をかけて改善していますイメージング21中に非侵襲的刺激を可能にする光学系。これらの可能性は、電気刺激では使用できません。
しかし、脳内の光伝達のために、組織の加熱から生じる信号アーチファクトは、緩和時間の温度による変形がpseuを生成することが示された22の報告されていますアクティベーションを行います。 ofMRIを行う研究者は、したがって、この潜在的な交絡に注意する必要があります。適切なセットアップとコントロールを使用して、問題に対処することができます。また、fMRIの中の血行力学的応答を測定する比較的低い時間分解能は、本技術の特定の用途を制限する要因であり得ます。
このプロトコルは、第1ディープin vivoでの脳への光の特定の波長の配信を可能にする光ファイバインプラントの構築を記載します。プロトコルは、その後、定位手術を使用して、正確な脳領域へのオプシンをコードするウイルスベクターの送達を記載します。次のプロトコルは、同時光刺激中の全脳機能的MRIのプロセスについて説明します。最後に、プロトコルは、取得したデータの基本的なデータ分析の概要を説明します。
注目すべきは、ここで説明した光遺伝学は、光配信のための慢性移植を必要とします。しかし、光ファイバインプラントは安定したバイオあります互換、縦スキャンおよび月23,24の期間にわたって神経回路の研究を可能にします。
要約すると、正確な刺激とofMRIの全脳モニタリング能力は、脳のconnectomicsの研究のための強力なツールをofMRI作る上で重要な要因です。異なる動物モデルと結合した場合に加えて、神経疾患25の機構に新たな洞察を提供することができます。実際、ofMRIは発作8に関連した別個の海馬の小領域のネットワーク活動を解明するために使用されています。そのため、システムレベルの神経科学の質問に答えることに興味研究所が重要なこの手法があります。
撮影時の被写体の動きは、データの破損につながる可能アーティファクトの重要な供給源です。適切イメージングクレードルに動物を確保することは、適切な麻酔レベルを維持しますのようなアーティファクトを最小限に抑えることができます。ここでは、イソフルランを使用するが、このようなメデトミジンまたはケタミンとキシラジンなどの代替麻酔薬も、考慮すべきです。しかし、麻酔のレベルと選択は、BOLD応答28を含む、脳内の多くのパラメータに影響を与えることができます。イソフルランは、神経細胞の興奮29の変化を引き起こす可能性があります。他の麻酔薬はまた、GABAシナプス抑制30に影響を与えることができます。神経活動に影響を与えるその能力与えofMRIを行う際にこのように、麻酔の選択が重要です。麻酔の不在下でofMRIは可能ですが、動物が慣れている場合低減させることができる動物、から増加した動きに挑戦することができます。このような目を覚ましofMRIの研究は、以前に行われてきましたND脳9,10に麻酔の交絡効果を避けるだろう。後処理モーション補正アルゴリズムは、非常に動きの影響を緩和するために使用することができます。これらの方法のいくつかは、二乗和が補正下で基準画像と画像の機能をコスト最小化、このプロトコルに用いられる逆ガウス・ニュートン法、などが存在します。それは処理時間27を減らすためにGPUの並列プラットフォームの設計を使用して、高速かつ堅牢な動き補正を可能にしますので、アルゴリズムが便利です。
このプロトコルでデータの再構築については、MATLAB環境でカスタム書かれたソフトウェアは、螺旋状のサンプルがグリッド化画像31-33にk空間で再構成された2次元のグリッディングの再構築のために使用されました。時系列データは、刺激の前に収集し、ベースライン期間の各ボクセルに対するBOLD信号の変調率を算出することによって生成しました。その時系列のsynたボクセル活性化されたボクセルと定義した0.35以上のコヒーレンス値を持つ光遺伝学の刺激のブロックにchronized。このコヒーレンスの値が10未満-9 P値8に相当します。フーリエ変換の大きさは全ての周波数成分8,27の和の二乗で割った反復刺激サイクルの周波数に変換するようにコヒーレンス値を計算しました。 Familywise誤差は多重比較のためのボンフェローニ補正を用いて制御することができます。分析の別の方法は、一般的な線形モデル(GLMS)などのパラメトリック統計検定を含め、使用することができます。コヒーレンス法は、従来の一般的な線形モデルに比べてHRFの少ない事前知識を必要とします。 ofMRIを使用してデータを探索する場合したがって、有利です。間隔刺激間固定し、他のイベントRELAでofMRIデータに使用することができないとしかしながら、コヒーレンス法は、ブロック設計または選択されたイベントに関連するデザインのデータのために使用することができますテッド・デザインまたは混合デザイン。その後、動的な因果モデル(DCM)はofMRIによって同定脳領域間の相互作用を分析するために使用することができます。 DCMは、fMRIの34時の実験入力に対するシステム応答からの機能の接続性の分析のために開発ベイズ統計的手法です。
ofMRIのための追加の技術的な問題は、ここで議論されています。インプラントは、研究から影響を受けた動物の除去につながる、破損したり脱落することができます。再移植手術が原因で、元の移植手術と動物福祉の問題に起因すると同じROIを標的とする追加の不確実性には推奨されません。なぜなら、各動物の対象に投資し、時間と資源のかなりの量の、材料の強度を考慮はofMRI研究での使用に適した歯科用セメントを選択する重要な関心事です。移植手術はimplanの寿命を最大化する上で重要な要因でありますトンと動物対象。例えば、頭蓋骨は、歯科用セメントを適用し、セラミックフェルールインプラント周囲にセメントの十分な量を配置する前に乾燥していることを保証することが研究中の動物の潜在的な数ヶ月にわたるタイムライン上で安定性を確保することができます。さらに、代替ケージの設計が検討し、多くの場合、ケージに突出しており、インプラントに損傷を与える動物のための機会を提供する食料と水を保持するワイヤートップスとケージを回避するために、地元の動物保護施設で議論することができます。重要なことは、歯科用セメントは、イメージングおよび代替セメントは動物実験に使用する前にスキャナでファントムとイメージングに適用することによって試験することができる影響を及ぼすアーチファクトを低減するために慎重に選択する必要があります。様々な歯科用セメントとの試行錯誤は、このプロトコルで使用するセメントは、比較的少数の人工物を与えることが示されています。 ofMRIを行う際に他の技術的課題は、EXTR与えられ、意図したROIにおける光ファイバの配置の精度であります脳35中の核の間に存在することができるemely小さな距離。移植手術を完了した後、T2強調解剖学的スキャンは脳地図上に重ね合わせて、正しい配置を決定するために使用することができます。これらの手術を行う外科医と実践のスキルが正しい配置率を向上させることができます。意図されたROIにおけるオプシンの特異性および発現は、免疫組織化学または可視化のためオプシンにタグ付けされたレポータータンパク質の内因性の蛍光を用いて、動物を灌流し、脳を固定することにより、研究の終了時に確認することができます。これらのレポータータンパク質はまた、オプシンが所望の神経細胞型1,8,15,25において発現されることを確実にするために、他のタンパク質と共局在することができます。前述のように光による配信22から組織加熱にofMRIを行う際に、アーチファクトが発生することがあります。組織加熱は、偽BOLD信号をもたらす、緩和時間の変更を引き起こします。その交流を確実にするために、ofMRI中に光刺激から生じるtivationはこのアーティファクトによるものではない、オプシンネガティブコントロールは、(AAV-CaMKIIa-EYFPなど)の制御蛍光体ベクターを注射し、生理食塩水を注射した動物や動物そのいずれかで実行する必要がありますofMRIを受けます。また、良好な光透過効率でのみうまく構築光ファイバインプラントは、高いレーザパワーを使用する必要性を除去するために使用されるべきです。 ofMRIの研究が原因で組織加熱に偽の活性化が問題1,6-8,10,11されていないここで行われてきました。
発現のためのニューロンに必要な光遺伝学の遺伝子を導入するためのベクターの選択については、のAAVは、ヒトの疾患を引き起こすことが知られているので、便利なオプションである、これらの薬剤(BSL-1)を使用するために必要な低いバイオセーフティレベルを与えられていません。また、ベクトル・コアの多くは、在庫の様々な光遺伝学の遺伝子とし、複数の血清型と一緒にパッケージのAAVを運びます。 AAVの血清型はBを選択されなければなりません最適な発現レベル36,37を確実にするために意図された細胞集団を対象にASED。レンチウイルスは、また使用されるが、より高いバイオセーフティーレベルを必要とすることができます。光遺伝学の遺伝子の十分な発現のために必要な時間は、使用される特定のAAVにし、具体的な実験パラダイムに、使用される特定の動物モデルに応じて可変です。このプロトコルでは、11週齢でのSprague Dawleyラットを使用し、光遺伝学研究は、4〜6週間ウイルス注射後始まります。トランスジェニックマウスはまた、光遺伝学の研究において使用され得ます。オプシンの十分な発現のために必要な時間の特定の量を決定するために予備実験を行う必要があります。刺激パラダイムは、使用される特定のオプシンに応じて変えることができます。このプロトコルでは、AAV5-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFPが使用され、刺激パラダイムは/ 40秒オフで20秒です。 SSFOを使用している場合SSFOが交流する光の唯一の短いパルスを必要とするため、刺激パラダイムが変化しますtivatedし、別の波長の光の短いパルスが終了します。
実行時に追加の重大な懸念はofMRIは、動物を麻酔した場合でも、視覚刺激から生じる交絡脳の信号を防止するために、光遺伝学刺激中の光ファイバパッチケーブル付きフェルールインプラント・インターフェースからの光漏れを防止されます。黒色絶縁テープの円錐は、フェルールの光を遮断すると、動物の目をカバーするために使用することができます。重要なことは、被検者の呼気CO 2や体温などの生理的値は、適切にイメージングの期間を通じて維持されなければなりません。 37℃で4%であり、体温-呼気CO 2を 3との間に維持されるべきです。また、シム配列の前ofMRIが大きくスキャン得BOLDデータの品質を決定開始する磁場にできるだけ不均一性を低減します。これらの要因の制御信頼性の高いofMRIデータを生成する上で重要です。このプロトコルでは、DPSSレーザは、光遺伝学刺激のための光源として使用されます。レーザ光がコヒーレントであるため、十分な電力よりも、容易に光ファイバを介して供給することができます。光ファイバに接続されたLED光源は、商業ベンダーから利用可能であるが、光の透過の減少電力の欠点を有しています。レーザ光源は、それぞれの特定の光ファイバパッチケーブルの配置を必要とするが、実際と、アラインメントは数秒〜数分以内に達成することができます。
ofMRIの将来のアプリケーションは、撮影時の非侵襲的刺激を有効にするには、赤方偏移オプシンなどの次世代のオプシンの使用を含みます。さらに、MRI対応EEGまたは光ファイバ・インプラントと一緒に同様の記録電極の注入は、MRIの高空間分解能のデータに加えて、高時間分解能データの取得を可能にすることができます。 ofMRIとelectrophysiological記録は、脳の機能的接続性に関する広範な情報を提供することができます。要約すると、遺伝的または解剖学的アイデンティティによって定義された特定の細胞集団の刺激に応答して脳全体を監視するofMRIのパワーは、神経疾患のと健康な脳のconnectomicsの研究に使用するための重要なツールをofMRIなります。
The authors have nothing to disclose.
This work was supported through funding from the NIH/NIBIB R00 Award (4R00EB008738), Okawa Foundation Research Grant Award, NIH Director’s New Innovator Award (1DP2OD007265), the NSF CAREER Award (1056008), and the Alfred P. Sloan Foundation Research Fellowship. J.H.L. would like to thank Karl Deisseroth for providing the DNA plasmids used for the optogenetic experiments. The authors would also like to thank Andrew Weitz and Mankin Choy for editing the manuscript and all the Lee Lab members for their assistance with the ofMRI experiments.
7 Tesla scanner | Agilent Technologies | Discovery MR901 System | |
Sprague Dawley rats | Charles River | Crl:SD | 11 weeks old |
fiber cleaver | Fujikura | CT-05 | |
multimode optical fiber | Thor Labs | AFS105/125Y | |
fiber stripper | Thor Labs | T08S13 | |
ceramic split sleeve | Precision Fiber Products | SM-CS1140S | |
epoxy glue | Thor Labs | G14250 | |
cotton-tipped applicators | Stoelting Co. | 50975 | |
multimode ceramic zirconia ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2002 | |
FC/PC multimode connector | Thor Labs | 30128C3 | |
fiber optic polishing disk | Precision Fiber Products | M1-80754 | |
aluminum oxide lapping sheet, 0.3 µm | Thor Labs | LFG03P | |
aluminum oxide lapping sheet, 1 µm | Thor Labs | LFG1P | |
aluminum oxide lapping sheet, 3 µm | Thor Labs | LFG3P | |
binocular biological microscope 40X-1000X | Amscope | B100 | |
laser safety glasses | Kentek | KXL-62W01 | |
473 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0473 | |
594 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0594 | |
Allen hex wrench set | 2.0 mm (5/64") for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser | ||
power meter, Si Sensor, 400-1100 nm | Thor Labs | PM121D | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | |
isoflurane vaporizer with induction chamber | VetEquip | 901806 | |
NanoFil 100uL syringe | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | |
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
function generator | A.M.P.I. | Master-8 | |
small animal stereotax | David Kopf Instruments | Model 940 | |
Model 683 small animal ventilator | Harvard Apparatus | 550000 | |
Type 340 capnograph | Harvard Apparatus | 733809 | |
dental drill (rotary micromotor kit) | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
ophthalmic ointment (Artificial Tears) | Rugby | 00536-6550-91 | |
instrument sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | glass bead sterilizer |
antibiotic powder | Pfizer | NEO-PREDEF | neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride |
buprenorphine painkiller | Hospira | NDC:0409-2012 | schedule III controlled substance , 0.3 mg/mL stock |