Fácil y Precisa mecanoterapia perfiles en micropost Arrays
Summary
Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.
Abstract
Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts.
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow “mechano-profiling” of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.
Introduction
Ensayos basados en células de mecanoterapia sensibles permiten investigar las células adherentes, con una amplia gama de aplicaciones que reflejan el papel central que la mecánica pueden desempeñar en la biología celular. Estas aplicaciones suelen centrarse en los mecanismos subyacentes que impulsan procesos subcelulares o el comportamiento de células enteras. Por un lado, los factores ambientales externos, tales como composición de la matriz extracelular o la rigidez de la matriz puede afectar dramáticamente la respuesta mecánica y biológica de una célula. 1 El mismo se puede observar después de su uso de muchas clases de compuestos farmacéuticamente activos, los efectos de los cuales son caracterizan a menudo el uso de modelos de cultivo celular. 2 En las otras propiedades genotípicas de mano, tales como las causadas por mutaciones genéticas espontáneas o inducidas experimentalmente, puede inducir cambios marcados en el fenotipo celular que están asociadas con alteraciones en la estructura y función del citoesqueleto. 3 Estos ejemplos son sólo algunos de los muchos posiblestemas para los que fenotipificación mecánica de las células es relevante, y todos ellos han sido útilmente investigado con matrices micropost.
Al momento de escribir esto, alrededor de 200 artículos han sido publicados describiendo la interacción célula-micropost. Estas obras discuten aspectos teóricos de micropost principios de desviación, así como instrucciones prácticas sobre su fabricación. El primer artículo que describe la interacción de las células y matrices micropost flexibles fue publicado por Tan y sus colegas en 2003. 4 En contraste con la microscopía de fuerza de tracción clásica (TFM), donde se utilizan sustratos blandos continuos para estimar la contractilidad celular nanonewton escala, Tan et al. se describe un método que utiliza múltiples vigas verticales espaciados estrechamente hechos de elastómero de silicona. Las principales ventajas de esta técnica emergen de dos características principales. En primer lugar con el fin de cambiar la rigidez del sustrato de células aparente sólo se necesita cambiar las dimensiones micropost mientras se mantienela composición de otra manera constante y evitando de esta manera las diferencias en la topología de la superficie y la química del sustrato. Segundo microposts actúan como resortes individuales que se pueden analizar de forma discreta con la fuerza y la resolución espacial del orden de adhesiones focales individuales y pueden reducir los desafíos analíticos que son inherentes al análisis análoga por la norma TFM.
Hoy en día la gama de aplicaciones para las matrices micropost excede en gran medida sólo el mapeo de las fuerzas de unas pocas células individuales. Por ejemplo, Akiyama informa el uso de un aislado de tejido vaso dorsal a partir de una oruga de la polilla como un actuador para una matriz de micropost, con el fin de desarrollar un robot autónomo micro-músculo-accionado de insectos. 5
Sin embargo, las aplicaciones más publicadas de microposts se han centrado en los estudios de las condiciones médicas como infección o cáncer. Por ejemplo, las matrices micropost se han utilizado para estudiar la generación de la fuerza de liado IV pili tipo de Neisseria gonorrhOEA colonias que se asocia con la mejora de cascadas de señales infección. 6 Otros han utilizado microposts para estudiar las células de cáncer de mama tratados con compuestos farmacéuticos dirigidos a la citoesqueleto. 7
Desviación de un micropost se describe a menudo utilizando la teoría clásica de haz para un voladizo con una carga final asumiendo la célula se une sólo a la punta de la micropost. Aquí la fuerza aplicada F que provoca una deflexión δ depende de k "rigidez a la flexión" de la micropost y se calcula por:
(1)
con E, I, L y siendo el módulo de Young, área de momento de inercia y haz de longitud respectivamente. Sin embargo, los resultados de esta ecuación sólo dan una aproximación general de las fuerzas en el trabajo ya esquila viga y flexión, así como la deformación del sustrato no se tienen en accontar. Teniendo en cuenta que microposts se hacen típicamente de materiales blandos como polidimetilsiloxano (PDMS) basado en caucho de silicona estos factores deben ser incluidos. . Schoen et al demostraron que existe un factor de corrección tales basada en la relación de aspecto de la micropost (L / D) y del polímero correspondiente relación de Poisson v 8 Lo administra.:
(2)
Con T de inclinación (v) un coeficiente de inclinación que incluye como se puede encontrar en el mismo artículo de ajuste de parámetros a = 1,3:
(3)
Eso significa que la rigidez corregida de un micropost k corr es el producto de la rigidez a la flexión pura k = k se doblan y el factor de corrección corrdada por:
(4)
Por lo tanto, los cálculos de fuerza células deben realizarse utilizando la variación más refinada de la ecuación (1) ya la lectura:
(5)
El impacto de la corrección se hace más evidente tan pronto como se utilizan los valores típicos para las dimensiones micropost. Por ejemplo, una larga micropost 15 micras con una sección transversal circular y un diámetro de 5 micras hecha de caucho de silicona a base de PDMS conduce a un factor de corrección de 0,77 y por lo tanto un cálculo no corregida sería sobreestimar las fuerzas de células ejercida por 23%. Esto se hace aún más grave para microposts con relaciones de aspecto más pequeños.
Tradicionalmente, el análisis de imagen micropost también se ha basado en la viga idealizada teoría de la flexión. En 2005 el grupo que fue pionero en el uso de micrmatrices opost publicaron un software de análisis de imagen adecuado para el análisis micropost 9 El software requiere una licencia de software y el usuario debe tomar tres imágenes para cada posición.; uno de cada uno de los planos superior e inferior de la micropost en modo de transmisión y otro en modo de fluorescencia con la célula teñida. Después de comparar las posiciones superior e inferior para cada micropost el software determina un campo vector de fuerza y calcula los parámetros relacionados como la fuerza por correo. Existen otros paquetes de software y sus principios de análisis se mencionan brevemente en los artículos correspondientes que los describen, pero estos paquetes de software de análisis generalmente no están disponibles al público. 10,11
Las matrices micropost diseñados para las fuerzas de células mapeo se pueden clasificar como estar en una disposición ortogonal micropost o un ser hexagonal, el último de los cuales tienen la ventaja de huecos equidistantes entre todos microposts vecinos. Microposts típicos jave una sección transversal circular y sus dimensiones varían desde 1.0 micras a 10 micras de diámetro y de 2 a 50 micras de longitud. 4 Sin embargo, microposts con sección transversal elíptica o cuadrada también se han reportado 12,13.
El uso de mezclas de silicona a base de PDMS como material de micropost permite la adición de las nanopartículas en la mezcla. Por ejemplo la adición de cobalto nano-barras permite una activación magnética del micropost y por lo tanto da otro grado de libertad de los posibles diseños experimentales. 14 La mayoría de los grupos producen sus matrices micropost en sustratos rígidos planos como cubierta de vidrio o en el interior de una caja de Petri. Sin embargo, Mann y sus colaboradores informaron recientemente una serie micropost formado sobre una membrana elástica. 15 Esto permite que la aplicación de fuerzas de células estiramiento a células adherentes mientras estudiaba de células en vivo subcelular respuestas dinámicas en cuanto a la contractilidad celular.
El estab y más ampliamente empleadocido proceso para la fabricación de matrices micropost se basa en litografía blanda como se describe en los protocolos de Sniadecki interesantes y sus colegas 16-18. En los procesos de sala limpia estándar cortos se utilizan para generar las microestructuras en la parte superior de una oblea de silicio usando fotorresistente SU8. Esto es seguido por un proceso de copiado en el que el caucho de silicona se proyecta sobre las estructuras de la transferencia de ellos en los moldes. En una segunda etapa estos moldes se usan para replicar la microestructura inicial usando caucho de silicona en la parte superior de un sustrato elegido. Sin embargo a pesar del número grande y creciente de publicaciones relacionadas con su aplicación, estableciendo un proceso de fabricación de microposts lleva una considerable cantidad de tiempo incluso para los expertos micro-ingeniería; hay muchos pasos de proceso que requieren la optimización y adaptación al entorno de laboratorio específica y el diseño micropost para producir un nivel de calidad aceptable.
Matrices micropost comerciales están ahora disponibles en una lista-tformato o-uso ("off-the-shelf") con una alta calidad constante. Como tales, son una alternativa al proceso de fabricación complejo y largo requerido para la producción in situ. En este trabajo se utilizó una matriz micropost disponible en el mercado para el mapeo de las fuerzas celulares utilizando imagen de microscopía un solo campo brillante. Más importante este artículo describe y documenta un software de código abierto completamente funcional llamado MechProfiler, que está disponible para su descarga como material complementario a este manuscrito. Una versión mantenido activamente del software también se puede encontrar en http://www.orthobiomech.ethz.ch.
La combinación de un ensayo de "off-the-shelf" y un software de análisis de código abierto compatible reduce notablemente el obstáculo de entrada para lograr experimentos TFM precisos. Los investigadores no tienen acceso a cualquiera de las instalaciones de sala limpia o experiencia en el desarrollo de software pueden analizar las fuerzas celulares con éxito. Permite a un usuario a centrarse en los mechanossalida ensayo ensitivity en lugar de la tecnología en sí, y hace mediciones de fuerza de tracción a disposición de una comunidad más amplia. Además, este es un paso importante para allanar el camino hacia la detección completamente automática de matrices micropost.
El software de análisis MechProfiler procesa imágenes en formato tiff archivo, png, bmp y gif. Las imágenes pueden ser tomadas usando la fluorescencia, contraste de fase o el microscopio óptico de campo claro. El programa independiente se ejecuta junto con el Compiler Runtime libre de Matlab (disponible en: Figura 12) y los algoritmos subyacentes permite el procesamiento de imágenes aerodinámico, que permite al usuario procesar las imágenes con células individuales o múltiples en aproximadamente 1 min. Además, estas células o bien pueden estar viviendo o "fijos".
El software MechProfiler es capaz de aumentar en gran medida el análisis de datos de rendimiento basándose en la reproducibilidad de arrays micropost calidad comercial, más específicamente, el valor predeterminado & #8220; no desviada "posición de cada mensaje en la matriz puede presumirse en contra de una rejilla ideales (desviaciones de fabricación de la red en las matrices utilizadas para este estudio tenían menos de 100 nm).
En resumen se abre una selección de archivos de imágenes para el análisis, los cultivos de la región de interés, define los puestos de trabajo regulados por las células o que deben ser desechados, determina las posiciones de correos, calcula las desviaciones / fuerzas contra la red de ideales, y, finalmente, guarda todos los datos específicos de la célula con una posibilidad para la exportación, incluyendo a una hoja de cálculo estándar de oficina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabajo busca avanzar en el campo de la microscopía de fuerza de tracción al reducir sustancialmente los obstáculos técnicos y prácticos a la entrada. Estas barreras provienen de dos lados. En primer lugar están los numerosos desafíos técnicos no triviales que se deben superar para fabricar de forma reproducible y poner en marcha una serie micropost experimentalmente. En segundo lugar, es la necesidad de manera similar no trivial para un análisis semiautomatizado fiable de las fuerzas de células individua…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Committee Technology and Innovation (CTI) Switzerland grant 14796-PFLS-LSCTI. MicroPost arrays were generously provided by MicroDuits GmbH.
Materials
| T25 cell culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 1x PBS-buffer | Sigma | D8537 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400054 | |
| Medium DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
| FBS South America | Life Technologies | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x | Sigma | P4333 | |
| 15 ml centrifuge vials | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Micropost array | MicroDuits | MPA-col1/FN | Micropost dimensions: |
| pre-coated with Collagen I/Fibronectin | Ø= 6.4 µm, l=18.2 µm; grid= 13 µm, kcorr= 2.87 nN/µm | ||
| Ethanol abs p.A. | Merck | 100.983 | |
| 12-well plate | Nunc | 150628 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma | HT5011 | |
| Brilliant Blue G-250 | Sigma | 27815 | Coomassie blue |
| Methanol ACS p.A. | Merck | 1.06009 | |
| Acetic acid | Sigma | 695092 | |
| Glass bottom dish | WillCo Wells BV | GWSb-3522 | 35 mm diameter, aperture 22 mm |
| T-100 Eclipse | Nikon | n/a | Inverted microscope |
| D3-L3 | Nikon | n/a | Camera controler |
| DS Fi2 | Nikon | Camera |
References
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