Mécano-profilage facile et précis sur Micropost Arrays

Summary

sont décrits des protocoles pour quantifier les interactions mécaniques entre les cellules adhérentes et les substrats microstructurés. Ces interactions sont étroitement liées aux comportements cellulaires essentiels, notamment la migration, la prolifération, la différenciation et l’apoptose. Les protocoles présentent un logiciel d’analyse d’images open source appelé MechProfiler, qui permet de déterminer les forces impliquées pour chaque micro-post.

Abstract

Les substrats de culture cellulaire avec micro-tenons flexibles intégrés permettent à l’utilisateur d’étudier les interactions mécaniques entre les cellules et leur environnement immédiat. En particulier, les interactions cellule-substrat sont le principal intérêt. Aujourd’hui, les réseaux de micro-poteaux sont une méthode bien caractérisée et établie avec un large éventail d’applications qui ont été publiées au cours de la dernière décennie. Cependant, il semble y avoir une réserve parmi les biologistes pour adapter la technique en raison du processus long et difficile de fabrication des microposts ainsi que du manque de logiciels facilement accessibles pour analyser les images de cellules interagissant avec les microposts.

La lecture de la force à partir des microposts est étonnamment facile. Un micro-poteau agit comme un ressort avec la cellule idéalement fixée à son extrémité. Selon la taille, une cellule applique une force à partir de son cytosquelette à travers un ou plusieurs points d’adhésion focaux au micropost, déviant ainsi le micropost. La quantité de déflexion est directement corrélée à la force appliquée en direction et en amplitude. Le nombre de micropostes couverts par une cellule et les motifs de déviation des tenons sont caractéristiques et permettent de déterminer des valeurs telles que la force par tenon et de nombreux paramètres biologiquement pertinents qui permettent le « mécano-profilage » des phénotypes cellulaires.

Une méthode pratique de mécano-profilage est décrite ici, combinant la première génération de microposts prêts à l’emploi et disponibles dans le commerce avec un progiciel développé en interne qui est maintenant accessible à tous les chercheurs. À titre de démonstration d’application typique, des images uniques de cellules cancéreuses osseuses ont été prises en microscopie à fond clair pour le mécano-profilage de modèles de lignées cellulaires de métastases. Cette combinaison de capteurs de force de traction commerciaux et de logiciels open source pour l’analyse permet pour la première fois une mise en œuvre rapide de la technique du réseau de micro-poteaux dans les travaux de laboratoire de routine effectués par des utilisateurs non experts. De plus, un processus d’analyse robuste et rationalisé permet à un utilisateur d’analyser un grand nombre d’images de micro-publications de manière très rapide.

Introduction

Tests cellulaires mécano-sensibles permettent d'enquêter sur les cellules adhérentes, avec une large gamme d'applications qui reflètent le rôle central que peuvent jouer la mécanique en biologie cellulaire. Ces applications se concentrent souvent sur les mécanismes sous-jacents qui animent les processus intracellulaires ou le comportement de cellules entières. D'une part, les facteurs externes environnementaux tels que la composition de la matrice extra-cellulaire ou la rigidité de la matrice peuvent considérablement influer sur la réponse mécanique et biologique d'une cellule. ¹ La même chose peut être observée après utilisation de plusieurs classes de co....

Protocol

1. la culture de cellules sur Micropost Arrays

Remarque: Toutes les étapes doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique pour assurer la stérilité. Les volumes sont indiquées ici pour des flacons de culture T25 cellulaire. La densité de la recette et ensemencement cellulaire milieu de culture cellulaire sont optimisés pour les lignées cellulaires de cancer de l'os HuO9 et M132.

1. Préparer une culture de cellules pour l'ensemencement sur un réseau de micro-message.
   1. Inspecter la qualité d'une culture de cellules en plaçant le flacon de culture sur un microscope optique standard. Veiller à ce ....

Results

Le principal avantage de la technique décrite réside dans sa simplicité et le potentiel pour une intégration rapide et efficace dans le travail de laboratoire de routine. La combinaison des réseaux de capteurs commerciaux de haute qualité jumelés avec des logiciels open-source fournit des informations sur la mécano-sensibilité qui autrement nécessite l'accès à des installations de salles blanches et d'une connaissance approfondie de l'analyse de l'image et le développement de logiciels. La figure 1 illustre

Discussion

Ce travail vise à faire progresser le domaine de la force de traction microscopie en abaissant considérablement les obstacles techniques et pratiques à l'entrée. Ces obstacles proviennent de deux côtés. Tout d'abord sont les nombreux défis techniques non négligeables qui doivent être surmontés pour la fabrication reproductible et mettre en service un réseau de micropost expérimentalement. Deuxièmement, la nécessité est de même non négligeable pour une analyse semi-automatique fiable des forces de cellules unique.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fioles de culture cellulaire T25	Nunc	156367
1x tampon PBS	Sigma	D8537
0,5 % Trypsine-EDTA	Life Technologies	15400054
Medium DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS Amérique du Sud	Technologies	10270106
Pénicilline-Streptomycine 100x	Sigma	P4333
Flacons à centrifuger 15 ml	Sarstedt	62.554.502  ;
Réseau de micropoteaux pré-enduit de collagène I/Fibronectine	MicroDuits	MPA-col1/FN	Dimensions du micropoteau : Ø ;=6.4  ; et micro ; m, l = 18,2 et micro ; m; grille=13 & micro ; m, kcorr=2.87  ; nN/µ ; m
Éthanol abs p.A.	Merck	100.983
Plaque 12 puits	Nunc	150628
Solution de formol, tamponnée neutre 10 %	Sigma	HT5011
Bleu brillant G-250	Sigma	27815	Bleu Coomassie
Méthanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Acide acétique	Sigma	695092
Plat à fond en verre	WillCo Wells BV	GWSb-3522	35 mm de diamètre, ouverture 22  ; mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Microscope inversé
D3-L3	Nikon	n/a	Contrôleur d’appareil photo
DS Fi2	Appareil photo	Nikon