In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.
Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.
أثناء التطور الجنيني والأنسجة والتشكل الجهاز تتم عن طريق برنامج دقيق يمكن وصفها من حيث تكاثر الخلايا، والهجرة الخلية ومواصفات النسب 1-4. وتشارك هذه العمليات البيولوجية أيضا في الحفاظ على توازن الأنسجة الكبار، الأمر الذي يتطلب وقف تجديد الخلايا. تتبع النسب، وتحديد وتتبع ذرية من نوع معين من السكان الخلية، ويوفر أداة هامة لدراسة التطور الجنيني ووقف توازن الخلية. في الواقع، يتزايد استخدامه في العديد من مجالات البحث. بشكل خاص، أصبح البحث عن المفقودين النسب أداة أساسية في تحديد منشأ ومصير الخلايا الجذعية في التوازن وسرطان التنمية. هذا هو لأنه قد تقدم معلومات أساسية حول كيفية سلوك الخلية في سياق أنسجة سليمة أو الحي، مع التدخل التجريبي الحد الأدنى، على النقيض من العزلة الخلية والثقافة في المختبر أو transplantatiعلى هذا قد يؤدي إلى تحيز غير المرغوب فيها.
تقليديا، والأصباغ مثل الدهون القابلة للذوبان carbocyanine، الذي تدرج في الغشاء البلازمي للخلايا، واستخدمت لتتبع النسب. على الرغم من أن هذه الأنواع من التجارب أدت بنجاح إلى الاكتشافات الكبرى والمفاهيم الأصيلة شكل في البيولوجيا التطورية 5،6، لديهم بعض القيود، بما في ذلك صعوبة في السيطرة على خصوصية الخلايا المستهدفة، وتأثير غير مرغوب فيه من الصبغة على سلوك الخلية والتخفيف التسمية مع مرور الوقت. وقد مكنت النوكليوتيدات نهج وضع العلامات التماثلية توثيق وجود بطء في سباق الدراجات "التسمية الاحتفاظ الخلايا" التي تتوافق يفترض أن هادئة الخلايا الجذعية 7،8. ومع ذلك، في حين أن هذه التقنية يمكن أن تثبت وجود خلايا الدراجات بطيئة تقوم على حركية الانتشار على مدى فترة زمنية محدودة لا يمكن أن تقدم أفكارا جوهرية بشأن وظائف الخلايا الجذعية. أمثل المنهجيات تتبع النسبodology يجب تقليل تأثير وضع العلامات على خصائص الخلية ملحوظة، نسله، أو جيرانه. بالإضافة إلى ذلك، سيكون من المفيد أن يكون السيطرة على تحريض وضع العلامات، وهي لديها القدرة لوضع علامة على السكان خلية من الاهتمام في مرحلة والوقت بطريقة تعتمد وكذلك في خلية واحدة (نسيلي) الطريقة. طريقة وضع العلامات مستقرة ولا رجعة فيه التي يتم تمريرها إلى جميع ذرية الخلية مؤسس من الأهمية بمكان بحيث سيتم الإبقاء على التسمية مع مرور الوقت، وليس نقلها إلى الخلايا المجاورة.
وفي الآونة الأخيرة، وقد وضعت نهج الجينية لوضع العلامات الخلية. في هذه الأنظمة، المروجين خلية معينة يمكن استخدامها لتحريك لجنة المساواة العرقية recombinase التعبير من أجل إزالة حاجز-يحيط loxP والسماح للتعبير عن الجينات مراسل مثل البروتين الفلوري الأخضر أو Β غالاكتوزيداز الجينات مراسل 13/09. هذا النهج يمكن ليس فقط تتبع الخلايا وذريتها ولكن يسمح أيضا الخليةolation والتوصيف الجزيئي. أصبحت تتبع الخلية على مستوى خلية واحدة ممكن عن طريق تحريض التعبير عن واحد الفلورسنت الجين المراسل. واحد الحد هاما في هذه المنظومة هو حقيقة انه فقط عندما يتم المسمى نسبة ضئيلة جدا من خلايا فمن الممكن لفصل وتعقب الحيوانات المستنسخة الفردية. للتغلب على هذا القيد للصحفيين متعدد الألوان يمكن استخدامها. عند استخدام الوسم متعدد الألوان، تتبع مصير الفرق من الخلايا المجاورة في نفس مكانة يمكن أن يتحقق بكفاءة 14-17. مؤخرا، تم تطوير مجموعة متنوعة من Brainbow (برازيلي) الأليلات عن النسب تتبع التجارب، مما تعبير العشوائية متعددة الجينات مراسل فلوري الاستفادة من لجنة المساواة العرقية / نظام السلمون المدخن. يتكون نظام لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن من recombinase الانزيم لجنة المساواة العرقية، التي تعترف وتربط لتسلسل الحمض النووي محددة مثل مواقع loxP. بعد ملزم من لجنة المساواة العرقية recombinase، يحدث إعادة التركيب موقع معين، والذي يسبب إزالة loxP يحيط تسلسل resultinز في التعبير عشوائي من البروتينات الفلورية مختلفة (يوصف آلية أدناه). هي مجموعة متنوعة من خطوط برازيلي المتاحة للاستخدام (انظر ملاحظات 16،18،19). وتشمل الاختلافات الرئيسية بين سلالات برازيلي (ط) فروق في عدد من الجينات الفلورية المدرجة في الكاسيت، تتراوح ما بين 2 (برازيلي 2.0)، 3 (Br1.0) إلى 4 (Br1.1، Br2.1) الجينات الفلورسنت ، (ب) وجود مواقع السلمون المدخن الموجه متبادل للسماح للانقلاب الجين (Br2.0-2.1)، (ج) نوع من المواقع السلمون المدخن استخدامها، و (د) التعبير أو الصمت من الفلورسنت التعبير الجيني قبل تفعيل لجنة المساواة العرقية. تقدم BR3 التي أنشئت مؤخرا افضل طريقة للتصوير متعدد الألوان من الخلايا العصبية. واحدة من السمات الرئيسية لهذا النص هو أنه يحتوي على مجموعة جديدة من صامد البروتينات الفلورية farnesylated، التي تمكن حتى تلطيخ من أرقى العصبية بمعالجة 20.
الأهم من ذلك، قد تحتوي على إصدارات مختلفة من الأشرطة الأخ وتحديدا الخلايا العصبية Thy1 العلاقات العامةomoter أو بتواجد مطلق أعرب CAG (CMV) مروج. وأخيرا، في حين أن بعض الفئران المعدلة وراثيا برازيلي قد تحتوي على الأخ التحوير واحد، قد تتكون الآخرين النسخ التحوير متعددة، مما يسمح للإنتاج عدد هائل من الاحتمالات لتركيبات الألوان إلى أن تتجلى في كل خلية (انظر على سبيل المثال 16).
في دراستنا، استخدمنا الماوس R26R-النثار الذي يحتوي على برازيلي 2.1 كاسيت 21. تم تصميم Br2.1 فريد للسماح العكس DNA لجنة المساواة العرقية بوساطة وليس فقط الختان بسبب التوجه المتبادل للمواقع loxP (الشكل 1). وبالتالي، يمكن لهذه الأحداث انعكاس / الختان التي تؤدي إلى تغيير لون يستمر طالما جنة المساواة العرقية موجودة 16. لهذا السبب، وهو نظام الزمني التعبير لجنة المساواة العرقية محرض أساسي لتتبع الخلية موثوقة باستخدام Br2.1. كما هو مبين في الشكل. 1، وBr2.1 يحتوي على مروج CAG في كل مكان تليها يحيط loxP الجدد R -casseتتيه، الذي يعمل بمثابة حاجز النسخي، التي تبعتها 4 الجينات الفلورية مراسل والترميز للأخضر (GFP) والأصفر (YFP) والأحمر (RFP) وسماوي (CFP) البروتينات الفلورية المتمركزة في اثنين من المقعدين. وأعرب عن أي مضان قبل تفعيل لجنة المساواة العرقية. تحريض لجنة المساواة العرقية recombinase يسبب إزالة كاسيت النيو-R تمكين التعبير عشوائي واحدة من 4 البروتينات الفلورية في خلية معينة. يحتوي الجزء الأول GFP-يحيط loxP وYFP عكس، في حين أن الجزء الثاني يحتوي على RFP-يحيط loxP وCFP عكسه. قد باستمرار أن يكون مقلوب هذه القطاعات DNA (باستخدام loxP التي هي في اتجاه عكس)، أو رفعه، ما دام لجنة المساواة العرقية recombinase موجودا. لذلك، يجب استخدام لجنة المساواة العرقية التحوير عابرة والسيطرة عليها. يوفر كاسيت Br2.1 نظام ممتاز للتمييز بين انبعاثات متداخلة على موقع الإشارة: التعبير عن YFP وطلب تقديم العروض هو حشوية، وGFP هو النووي وCFP منضما إلى غشاء الخلية. GFPوانبعاثات طلب تقديم العروض يتم فصلها بسهولة بواسطة المجهر الفلورسنت التقليدية. من أجل فصل الانبعاثات YFP / GFP / CFP، هناك حاجة إلى نظام التصوير متحد البؤر الطيفية. وإجمالا، الكاسيت Br2.1 يسمح للتعبير معين عشوائي، محرض، والأنسجة واحد من أصل أربعة جينات الفلورسنت متميزة في كل خلية المستهدفة. في الواقع، عندما تكون هناك حاجة لعدد أكبر من تركيبات الألوان، واحدة يمكن أن تولد الفئران متماثل التي تحتوي على 2 الأليلات من Br2.1، مما أدى في التعبير عن 2 علامات اللون لكل خلية ورفع عدد من تركيبات الألوان الممكنة ل10 22 وبعض سلالات الفئران برازيلي تمكين التعبير عن عدد أكبر بكثير من تركيبات الألوان الممكنة منذ تم دمج عدة نسخ من الكاسيت إلى جيناتهم 16. بعد ذلك، في معظم الحالات، وتركيبات الألوان الأربعة التي قدمتها أليل Br2.1 واحدة تكفي. بعد بروتوكول المقدمة هنا، يمكن للمرء أن إقامة هذه الطريقة باستخدام الإعداد بسيطة نسبيا من SPECTRآل المجهري مع قليل إن وجدت الحاجة للمعايرة.
هنا نقدم بروتوكول للتكيف لاستخدام الفئران R26R-النثار التي تحتوي على أليل Br2.1 واحد، حيث ينتسب تتبع تجارب ظهارة القرنية. وقد استخدمت هذه السلالة الماوس المعدلة وراثيا لدراسة منشأ ومصير القولون 21،23 والخلايا الجذعية الظهارية القرنية 22،24، فإن وجود نشاط الخلايا الجذعية في سرطان الأمعاء 25، وتميز خلية رجلاء الكلى في الكبيبات القطعي الوصل (FSGS) 17.
وقد أجريت النسب تتبع تجارب لسنوات عديدة. التحسينات التكنولوجية الحديثة وظهور سلالات الفئران النثار فتحت آفاقا جديدة للبحث. اليوم، يمكن للباحثين الاستفادة من عدد كبير من المتاحة تجاريا خطوط جنة المساواة العرقية الأنسجة محددة، الفئران خروج المغلوب والفئران المعدلة وراثيا. وهذا يوفر فرصة لتصميم النظم التجريبية تنوعا لمعالجة المسائل العلمية ذات الخبرة الأساسية، وتجنب ممارسة شاقة، مع توفير بيانات موثوقة ويمكن الاعتماد عليها.
الفئران R26R-النثار هي أداة ذكية لتتبع كفاءة ودراسة طبيعة وسلوك الخلايا في كائن حي. هذا النظام هو من السهل اقامة وأنه يتيح تتبع النسب غير الغازية من الخلايا واحدة خلال مرحلة التطور الجنيني، تنبع تجديد الخلايا تحت التوازن، أو في ظل ظروف مختلفة مثل الإصابات والالتهابات والسرطان. يوفر البيانات التي يمكن الحصول عليها من المكتوية قويأيون بقاء الخلايا المستهدفة، والتوسع خلية نسيلي والهجرة الخلية، بطريقة قابلة للقياس الكمي. ومن شأن خطوة حاسمة تتمثل في اختيار سلالة الماوس الوراثي المناسب الذي يمكن أن تسمح موثوق وضع العلامات المحددة الأنسجة فعالة في مرحلة تنموية دقيقة. واحد الحد من هذا النظام هو أن لرصد كائن حي، يجب أن تكون الأنسجة الوصول وشفاف. وبالمثل، تتبع الأنسجة السميكة داخل الحيوانات الحية قد يتيسر إلا من قبل اثنين من الفوتون أو متعدد الفوتون المجهري. ومع ذلك، تتبع الخلية ممكن على أقسام الأنسجة بعد الوفاة وربما أنسجة سليمة يمكن دراستها بعد أن تم تحويله لتصبح شفافة من خلال طريقة وضوح 32،33. قيود أخرى ينبغي النظر فيها هو أنه على الرغم من الخلايا المجاورة التي تعبر عن نفس fluorophore المرجح تنتمي إلى نفس النسب نسيلي، فمن الممكن أيضا أن أنها قد تكون مشتقة من الأصل خلية المستقل الذي أعرب عشوائيا نفس الجين الفلورسنت. هذا possibiliيصبح تاي المستبعد جدا عند استخدام عدة الأليلات برازيلي للسماح العديد من تركيبات الألوان.
في المستقبل، والجمع بين نظام النثار مع الأدوات الوراثية المتاحة (أي خروج المغلوب، ونماذج الماوس knockin والمعدلة وراثيا) سوف تسمح للدراسة الجينات والطفرات في الصحة وعلم الأمراض. وعلى نحو مماثل، نسب تتبع تحت اضطرابات النظام المختلفة (أي وقف تدمير مكانة الخلية، الليزر بوساطة الخلايا الاجتثاث، علاج إدمان المخدرات) سيجلب رؤى جديدة على تورط مسارات إشارات في اتخاذ القرارات مصير الخلية. في نهاية المطاف، واستخدام اندماجي لوضع العلامات الفلورية وتلألؤ بيولوجي، وصحفيين الجيني للمسارات إشارات وأحدث المجهر توفر الباحثين جود نظام دقيق لمعرفة كيفية الخلايا وحيدة الرد على المحيطة بها في بيئتها الأصلية.
The authors have nothing to disclose.
RSF has received funding from the European Union’s – Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013]) under grant agreement n° 618432 – MC—Epi-Patho-Stem, as well as by the Israeli Science Foundation (218/14).
R26RConfetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette. | Jackson | strain #013731 | |
K14CreERT2 mice | Jackson | strain #005107 | |
tamoxifen | Sigma | T5648 | |
isoflurane USP Terrell | Piramal Critical Care | ||
Carprieve 30 | b.wt | ||
DMSO | Sigma | D2650 | |
DAPI | Sigma | D9542 | used at concentration of 4µg/ml |
Immu Mount | Thermo Scientific | 9990402 | |
LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage . | Zeiss | The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22). | |
Zen 2009 Imaging Software | Zeiss | ||
Duratears-eye ointment | Alcon |