Membrane Transport processus analysés par un système hautement parallèle Nanopore Chip à protéine unique Résolution

Summary

Le protocole présenté décrit l’analyse du transport médié par les protéines membranaires au niveau du transporteur unique à l’aide de bicouches lipidiques sans solvant couvrant les pores. Ceci est réalisé par la création de puces de réseaux de nanopores produites en vrac, combinée à l’acquisition et à l’analyse de données hautement parallèles, permettant la mise en place future de criblages effecteurs de protéines membranaires.

Abstract

Membrane transport des protéines au niveau de protéine unique échappe encore une analyse détaillée, si le substrat translocation est non-électrogénique. Des efforts considérables ont été faits dans ce domaine, mais les techniques permettant l'analyse automatisée de transport à haut débit en combinaison avec des techniques de bicouches lipidiques sans solvant requis pour l'analyse des transporteurs membranaires sont rares. Cette classe de transporteurs est toutefois crucial dans l'homéostasie cellulaire et donc une cible clé dans le développement de médicaments et de méthodologies pour acquérir de nouvelles connaissances désespérément besoin.

Le manuscrit présenté ici décrit la création et la manipulation d'un roman biopuce pour l'analyse des processus de transport de protéines membranaires médiation à la résolution du transporteur unique. La biopuce est composé de microcavités fermées par nanopores qui est hautement parallèle dans sa conception et peuvent être produits de qualité industrielle et de la quantité. liposomes Protein-hébergeant peuvent être directement appliquées àla surface de la puce formant des bicouches lipidiques pores transmembranaires auto-assemblées à l'aide de SSM-techniques (solide supporté membranes lipidiques). Pores transmembranaires parties de la membrane sont autonomes, fournissant l'interface substrat pour la translocation dans ou hors de l'espace de la cavité, qui peut être suivie par la lecture de fluorescence multispectral en temps réel. La mise en place de procédures normalisées d'exploitation (SOP) permet à la mise en place directe des bicouches lipidiques de protéines hébergeant sur la surface de la puce de pratiquement toutes les protéines de la membrane qui peut être reconstituée fonctionnellement. La seule condition préalable est la mise en place d'un système de lecture fluorescent pour les substrats de transport non électrogènes.

Les applications à haute teneur dépistage sont accomplishable par l'utilisation de microscopes automatisés fluorescents inversés d'enregistrement multiples puces en parallèle. Les grands ensembles de données peuvent être analysées en utilisant le logiciel d'analyse conçu sur mesure librement disponibles. Trois couleurs multiples spectrale fluorescentelecture permet en outre de discrimination de données impartiale dans différentes classes d'événements, ce qui élimine des résultats faussement positifs.

La technologie de la puce est actuellement basée sur SiO ₂ surfaces, mais fonctionnalisation supplémentaire en utilisant des surfaces de puces revêtues d' or est également possible.

Introduction

L'analyse des protéines membranaires est devenue d'un intérêt croissant pour la recherche fondamentale et pharmaceutique au cours des 20 dernières années. Le développement de nouveaux médicaments dépend de l'identification et de la caractérisation détaillée des nouvelles cibles, étant actuellement l'un des facteurs limitants. Le fait que 60% ​​de toutes les cibles médicamenteuses sont des protéines membranaires ^1, rend le développement de techniques pour élucider leur fonction la plus importante.

Dans le passé, des techniques pour l'étude des canaux électrogènes et les transporteurs ont été développés dans l....

Protocol

1. Préparation du Grand vésicules unilamellaires (LUV)

1. Nettoyer un ballon à fond rond (10 ml de volume) avec de l'azote gazeux pour éliminer les particules de poussière. Rincer le ballon à fond rond avec de l'éthanol.
   Remarque: L'éthanol résiduel peut être tolérée et ne perturbe pas les étapes ultérieures.
2. Laver un 1 ml 4x seringue en verre avec du chloroforme, pour éliminer toute contamination. Ajouter 4 ml SoyPC20 (25 mg / ml dans du chloroforme) dans le ballon à fond rond et à doper la solution de lipide DOPE avec une ^{ATTO 390} supplémentaire à une concentration finale de 0,1% en moles.
   Remarque: ....

Results

Les membranes de pores transmembranaires peuvent être facilement créées sur la surface de la puce de nanostructures d'une manière auto-assemblée. Toutefois, le processus sous-jacent est toujours délicate et influencée par de nombreux paramètres tels que la taille des liposomes, monodispersité de la population de liposomes, lamellarité, lipides et sel concentration et de surface chimique propriétés. La plupart de ces paramètres ont été soigneusement caractérisés et normalisés dans le prot.......

Discussion

La technique présentée ici permet une analyse très parallèle de transport des protéines de la membrane. des systèmes protéiques de la membrane reconstituée peuvent être directement appliquées sur la biopuce, ce qui rend l'adaptation de la théorie, chaque transporteur membranaire ou canaux possibles. l'analyse de transport est seulement limité par la mise en place d'un système de lecture fluorescente, soit par changement direct de fluorescence (translocation des fluorophores ou des substrats marqués par fluor.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(triméthylammonium)éthyl] méthanethiosulfonate	Toronto Research Chemicals Inc.	T792900	MTSET ; hydrolisé par l’eau. Conserver au sec à -80 °C. Utiliser immédiatement (30 minutes) après la solubilisation dans le tampon.
Seringue étanche au gaz de 1 ml	Hamilton	#1001
Fiole ronde de 10 ml	Schott Duran
2,7 mm billes de verre	Roth	N032.1
2-Propanole	Roth	9866.5
30 cm Luer-Lock Extension Tube	Sarstedt	744304
Acétone	Roth	5025.5
Bio-Beads SM-2 L’adsorbant	Bio-Rad	152-3920	doit être activé avant la première utilisation
CaCl2 Dihydrat	Roth	HN04.3
Calcein	Sigma	C0875	stocker sombre à -20 ° ; C
Réactif de chloroforme de qualité	VWR Chemicals	22711324
DOPEATTO390	ATTO-TEC	AD 390-165	stocker sombre à -20 ° ; C
Éthanol absolu	Sigma-Aldrich	32205
Injekt Seringue à usage unique	Braun	460 60 51V
Injekt-F Seringue à usage unique	Braun	91 66 017V
Pinces à keck	Schott	KC29
L-&alpha ;-Phosphatidylcholine, 20 % (soja)	Avanti Polar Lipids	5416016	stocker sous gaz inerte à -20 ° ; C
NaCl 99,5 % par an	Roth	3957.2
Nanopore E100 wafer/chips	Micromotive (Mayence/Allemagne)		disponible sur demande
Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 µ ; m	Whatman	800282
Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)	life Technologies	D-7173	stocker sombre à -20 ° ; C
Oy647	Luminartis (Mü ; nster/Allemagne)	OY-647-T-1mg	se conserve sombre à -20 ° ; C
seringue rotiabo, non stérile, taille des pores 0,22 & micro ; m	Roth	P 818.1
Sephadex G-50	Sigma-Aldrich	G5080	Matériau de colonne pour chromatographie d’exclusion stérique
Silastic MDX4-4210	Dow Corning		Agent de durcissement pour la fixation des copeaux sur le support en verre
de couverture collant-Slide 8 puits	ibidi	80828	Chambre multipuits pour le montage sur des lames de verre (porte-copeaux)
Robinet d’arrêt à trois voies bleu	Sarstedt	744410001
Tris Pufferan 99.9 % Ultra Qualité	Roth	5429.2
Triton-X 100	Roth	6683.1
Whatman 0.2 µ ; m filtre à membrane en nitrate de cellulose	Roth	NH69.1
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
>Equipment
Bü ; chi 461	bain-marie Bü ; chi
Bü ; chi Rotavapor RE 111	Bü ; Specttrophtomètre de fluorescence de l’éclipse de Chi
Cary  ;	Varian
LiposoFast Mini Extruder	Avestin
Pompe à membrane  ;	Vaccubrand	15430
Nanosight Microscope de suivi des nanoparticules	Malvern / Nanosight	LM 14C
Microscope NyONE	Synentec		disponible sur demande
Contrôle de la pompe	Vaccubrand	CVC 2II
Bain sonicateur Sonorex RK100H	Brandelin	31200001107477
Pompe à vide RC5	Vaccubrand	1805400204
Bain-marie W13	Haake	002-9910
Nettoyeur plasma PDC-37G	Harrick Plasma	PDC-37G
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
Software
ImageJ	http://imagej.nih.gov/ij/	scientifique de traitement d’images	open source
NanoCalcFX	Logiciel gratuit d’analyse	/évaluation de données http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ pour les ensembles de données cinétiques de transport massif
Logiciel analytique NTA 2.3 Logiciel d’acquisition	Nanosight		pour le suivi des nanoparticules microscope
NTA 2.3 Temperature Comms Logiciel de contrôle de	Nanosight		pour microscope de suivi des nanoparticules