ラット精巣からのセルトリ細胞と尿細管周囲細胞の単離

Summary

一次セルトリ細胞は精巣免疫特権、炎症または感染の間シグナル伝達、およびそれらの免疫防御特性の利用を研究するために必要とされます。ここでは、高度に精製された一次セルトリ細胞およびラットの精巣から管周囲の細胞を単離するための酵素ベースのプロトコルを記述します。

Abstract

分化した精子が最初思春期の時に表示されるので、精巣は、特に雄性配偶子に、独自の方法で免疫系に挑戦 – 十年以上全身性免疫寛容の確立後。精子形成細胞は、免疫系によって非自己として見ることができるタンパク質の数を表します。精巣は、その後、一方ではこれらのネオ抗原に対する寛容を確立することができるが、それでも一方、感染症や腫瘍の発生から自身を守ることができなければなりません。したがって、精巣は、有害な炎症性免疫応答を惹起することなく、外来抗原を容認し、体内のいくつかの免疫特権サイトの一つです。セルトリ細胞は精巣のこの免疫特権環境の維持のために重要な役割を果たし、また、外国の環境でcotransplanted細胞の生存を延長します。したがって、一次セルトリ細胞は、電子することはできません精巣の免疫特権を研究するための重要なツールですasily確立された細胞株または他の細胞モデルに置き換えられました。必要に応じて管周囲の細胞 – – ラットの精巣から一日以内にここでは、セルトリ細胞の単離のために詳細かつ包括的なプロトコルを提示します。

Introduction

精巣は、すなわち 、アンドロゲンを男性の配偶子と性ホルモンを産生します。臓器は、二つの区画で構成されています。総精巣容積¹の約10〜12％に相当する間質コンパートメントでは、ステロイドはライディッヒ細胞内で起こります。筒状の区画は、精巣容積¹の60〜80％に相当し、生殖細胞と体細胞の2種類含まれています-細管周囲細胞とセルトリ細胞を。精巣は、それぞれ1-3高い複雑な精細管を含む、250-300小葉に結合組織隔壁によって分割されます。これらの細管は、基底膜、コラーゲンのシート、及び管周囲細胞（ 図1A）の周層によって囲まれています。

胚上皮は、基底膜の腔側に位置しています。セルトリ細胞は、内腔への基底膜からの全胚上皮にまたがる大規模な細長い細胞です。彼らは強くあるのatt基底膜に痛んだし、間質から胚上皮を吸蔵および血液精巣関門を表す基底外側組織し、タイトジャンクショ​​ンを介して連続セルラーシートを形成。セルトリ細胞は、顕著な細胞質突起及び生殖細胞の種特異的であるが、一定数との緊密な形態学的および機能的な接触に入るためにそれらを有効に波及効果を持っています。二倍体胚性幹細胞は増殖し、精原細胞に分化します。

減数分裂の間に私短命の四倍体精母細胞が減数分裂IIの間に4半数体精子細胞へのさらなる発展が生成されます。それらは細胞のネットを形成するように、すべての生殖細胞質ブリッジによって相互接続されています。精子細胞の成熟の間の主なイベントは、精子と呼ばれるプロセスにおいて、残留体を形成し、細胞質の大部分の押出成形です。残留体はセルトリ細胞によって貪食されます。後期精子細胞は、その後に放出されます管状の内腔とさらに成熟のために精巣上体へ輸送。セルトリ細胞と生殖細胞が相互に地形的および機能的に精子形成を調整するように見えます。

小さ ​​な精巣片を培養し、細胞型顕微鏡²により同定したとき、個々の精巣の細胞型の調製は、ほぼ一世紀前に始まりました。先の細いピンセットを用いて白膜を開いた後の尿細管を注意深く解剖することにより、筒状の間質コンパートメント^3を分離するために、後に可能でした。 1975年にウェールズとウィーブは、間質組織と外管周囲細胞層⁴を除去するためのパンクレアチン処理を付着するの細管を解放するためにコラゲナーゼ処理を導入しました。早期から（古い20日前後）若い未熟ラットの精子形成がまだ始まっていないので、セルトリ細胞は、管状細胞集団の大部分を含んでいる使用されていました。この年齢ラットセルトでOLIの細胞は分裂をやめ、および隣接セル間のタイトジャンクション血液精巣関門が⁵確立されるように形成します。

ウェールズとウィーブDorringtonのらの独立は、トリプシンの組み合わせを導入し、同年⁶に出版されたsoybeenトリプシン阻害剤及びコラゲナーゼ処理が続くデオキシ。両グループは、また、約70％のセルトリ細胞を含むめっき均一な細胞懸濁液を生成するために、（それぞれ、シリンジ針またはパスツールピペットを介して繰り返し消化管状フラグメントを描く）機械的な力を用います。培養3日後に、血清を含まない培地を使用して、セルトリ細胞の割合は約90％に増加します。これは主に、生殖細胞を汚染の死に起因する可能性があります。残留管周囲細胞（のPTC）が、しかし、しっかりとそれらの細胞外マトリックスを介して結合したまま。 PTCではなく、セルトリ細胞を産生することが知られていますPTCを用いて汚染を推定するためのマーカータンパク質として働くことができるフィブロネクチン。従って、タンら。追加のヒアルロニダーゼ処理は、セルトリ細胞画分⁷の純度を向上させるかもしれないと推論しました。実際、それらは、さらなる処置を比較して、血清含有培地を精製したセルトリ細胞を培養するために使用される場合に特に明白となる、約20倍のPTCによる汚染を減少させることができたことを示す可能性があります。その後から桐らの改良された手順に。支配的なプロトコルとなり、広範囲のフィールド^8（ 図1B）内の他の主要なグループで使用されていました。

コラゲナーゼ処理中のPTCの大部分が放出され、セルトリ細胞と平行に単離することができます。 PTCを激しく増殖し、卵胞刺激ホルモン（FSH）に応答しないのに対し、セルトリ細胞は、もはや有糸分裂を受け、特徴的な形態学的変化によってFSHに反応しませんおよびサイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）濃度⁹の増加。非常に類似した酵素消化プロトコルは人^10、マウス^11、12、シベリアンハムスター¹³またはヤク¹⁴のような他の動物からの一次セルトリ細胞の単離のために使用することができます。生殖細胞を低張性ショックを汚染大量の除去のための単離手順¹⁵の端部に用いることができます。成体ラットは^、16精巣からこれはまた、セルトリ細胞の効率的な単離を可能にします。濃縮されたセルトリ細胞懸濁液は、 チョウセンアサガオ朝鮮朝顔アグルチニン¹⁷で被覆されたレクチン皿上懸濁液をプレーティングすることにより生殖細胞から分離することができます。唯一のセルトリ細胞といくつかの残留のPTCは、レクチンプレートに付着します。

主にラットからの一次セ​​ルトリ細胞培養物は、ホルモンに対する応答性を調査またはマウスのセルトリ細胞リチウムのような細胞株を確立するために最初に使用されていますTM4 ¹⁸ね。この細胞株は、今日まで、百以上の研究で検討されています。翻訳アプローチではセルトリ細胞は、全身性の免疫抑制¹⁹せずに長期移植片生存のための異種のまたは同種異系膵島の同時移植のように共培養細胞や組織の免疫保護のために利用されてきました。体細胞、生殖細胞（セルトリ細胞-生殖細胞^）20と^相互作用²¹ -単離されたセルトリ細胞は、上皮間葉（PTCCセルトリ細胞）を研究するため、共培養実験に使用されてきました。最近、一次セルトリ細胞は、Toll様受容体の発現と炎症性サイトカインの分泌、ならびに非病原性および尿路病原性大腸菌による感染後のサイトカインの発現をもたらすシグナル伝達カスケードを調査するために使用されています大腸菌 ^22。他の最近の研究は、精巣の免疫Pを研究するためのセルトリ細胞を使用していましたrivilege ²³およびテストステロン前処理は、LPS誘導性の炎症応答^{24を抑制することを}実証しました。

Protocol

1.動物倫理に関する声明ここで説明する実験は、地方自治体として、Regierungspräsidiumギーセン、ドイツのガイドラインに従って行い、実験目的のためのケアと動物の使用のための実践のドイツ語コード（許可なしに確認された：GI 20/23 Nrの31 / 2012）。 メディア、酵素溶液と動物の作製 100ミリリットルのエタノール中のヨウ素の1グラムを溶解することにより、1?…

Representative Results

説明する手順では、10ラットの精巣から約12×10 7セルトリ細胞の単離を可能にします。 6〜7 6ウェルプレートは、7日目の実験のために利用可能であることをトリプシンDNアーゼI消化がセルトリ細胞の単離中に最も重要なステップになるように3×10 6細胞を6ウェルプレートにウェル当たり播種します。この時点での消化が遠く前進された場合に、生殖細胞…

Discussion

The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, wh…

Materials

Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4	Dako	M0851	Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized	Serva	11930.04	Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence.
Corning™ Cell Strainers 70 µm	Corning	431751	White color
Collagenase A from Clostridium histolyticum	Roche	10103586001
DAPI mountant ProLong® Gold Antifade	Life technologies	P-36931
D-glucose	Sigma	G8644	100 g/l
Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+	Gibco	14190-094
DNase I	Roche	10104159001
Electron microscope	Zeiss	EM 109S
Fluorescence microscope	Zeiss	Axioplan 2
Hyaluronidase from bovine testis	Sigma	H3506
Inverted light microscope	Olympus	CKX41	Routine cell culture microscope
Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody	Life technologies	A-10684	Alexa Fluor® 488 conjugate
Oil Red O	Sigma	O0625	Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml)	Gibco	15070-063	100x solution
RPMI-1640	Gibco	21875-034	Contains 300 mg/L L-glutamine
Trypsin from porcine pancreas	Sigma	T5266
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T6522	The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche.
Vimentin antibody (V9)	Sigma	V6630	Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.  Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Wistar WU rats	Charles River	N/A	Should be 19 days old on day of experiment.