Isolering af Sertoliceller og peritubulære Celler fra rotte Testikler

Summary

Primære Sertoliceller er nødvendige for at studere testis-immune privilegium, signaltransduktion under betændelse eller infektion, og udnyttelse af deres immunbeskyttende egenskaber. Her beskriver vi en enzym-baseret protokol til isolering af højtoprensede primære Sertoliceller og peritubulære celler fra rotte testikler.

Abstract

Testiklerne, og især den mandlige gamet, udfordrer immunsystemet på en unik måde, fordi differentieret sperm først vises på tidspunktet for puberteten – mere end ti år efter etableringen af ​​systemiske immun tolerance. Spermatogene celler udtrykker en række proteiner, der kan ses som ikke-selv af immunsystemet. Testiklerne skal derefter kunne etablere tolerance over for disse neo-antigener på den ene side, men stadig være i stand til at beskytte sig mod infektioner og tumorudvikling på den anden side. Derfor testiklerne er en af ​​et par immune privilegerede steder i kroppen, der tåler fremmede antigener uden at fremkalde en skadelig inflammatorisk immunrespons. Sertoli celler spiller en central rolle for vedligeholdelse af denne immune privilegeret miljø af testiklerne og også forlænge overlevelsen af ​​cotransplanted celler i et fremmed miljø. Derfor primære Sertolicellerne er et vigtigt redskab til at studere immun privilegium testiklerne, der ikke kan være easily erstattet af etablerede cellelinjer eller andre cellulære modeller. Her præsenterer vi en detaljeret og omfattende protokol til isolering af Sertoliceller – og peritubulære celler hvis det ønskes – fra rotte testikler inden for en enkelt dag.

Introduction

Testiklerne producerer mandlige kønsceller og kønshormoner, dvs, androgener. Organet består af to rum. I det interstitielle rum, som repræsenterer omkring 10-12% af den samlede testikelkræft ^bind 1, steroidgenese foregår inden for Leydig-celler. Det rørformede kammer udgør ca. 60-80% af den testikel ^bind 1 og indeholder kimceller og to typer af somatiske celler – peritubulære celler og Sertoliceller. Testiklerne er delt af bindevæv septa i 250-300 lobules, hver indeholdende 1-3 stærkt snoede sædkanalerne. Disse tubuli er omgivet af en basalmembran, et ark af collagen, og et rundtgående lag af peritubulære celler (figur 1A).

Den germinale epitel er placeret på den luminale side af basalmembranen. Sertoliceller er store langstrakte celler, der spænder over hele germinale epitel fra basalmembranen til hulrummet. De er stærkt attgjorde ondt til basalmembranen og udgøre et sammenhængende cellulær ark gennem basolaterale organiserede tight junctions, der okkluderer germinale epitel fra interstitium og repræsenterer blod-testis-barrieren. Sertolicellerne har prominente cytoplasmatiske fremskrivninger og forgreninger, der sætter dem i stand til at komme ind i stramme morfologiske og funktionelle kontakt med en artsspecifik, men konstant antal kønsceller. Diploide germinale stamceller formering og differentiering til spermatogonier.

Under meiose I kortlivede tetraploide spermatocytter genereres der udvikler videre i fire haploide spermatider under meiose II. Alle kimceller er indbyrdes forbundet ved cytoplasmatiske broer således at de danner en cellulær net. Den væsentligste begivenhed under modning af spermatider er ekstrudering af store dele af cytoplasmaet, danner resterende organer, i en proces kaldet sædcelledannelse. Resterende organer fagocyteres af Sertoli celler. Sene spermatider derefter frigives tilde rørformede hulrum og transporteret ind bitestiklen for yderligere modning. Sertoliceller og kønsceller synes at gensidigt koordinere spermatogenesen topografisk og funktionelt.

Udarbejdelse af individuelle testikelkræft celletyper startede næsten et århundrede siden, da små testikel stykker blev dyrket og celletyper identificeres ved mikroskopi ^2. Ved omhyggelig dissektion af tubuli efter åbning tunica albuginea med fint-tippes pincet var det senere muligt at adskille rørformet og interstitielle rum ^3. I 1975 Welsh og Wiebe indført en kollagenase behandling for at befri tubuli i at hæfte interstitiel væv og en pancreatin behandling til fjernelse af det ydre peritubular cellelag ^4. Fra tidligt på unge umodne rotter (ca. 20 dage gamle) var blevet anvendt, hvor Sertoli celler omfatter en stor del af den rørformede cellepopulation fordi spermatogenesen ikke er begyndt endnu. I denne alder rotte SertOLI celler ophører med at dele sig, og tætte forbindelser mellem naboceller danner så blod-testis-barrieren er etableret ^5.

Uafhængigt af Welsh og Wiebe Dorrington et al. Indført en kombination af trypsin og deoxyribonuclease efterfulgt af soybeen trypsin inhibitor og collagenase behandling, der blev offentliggjort i samme år ^6. Begge grupper anvendes også mekanisk kraft (tegning de spaltede rørformede fragmenter gentagne gange gennem en sprøjtenål ​​eller en Pasteur pipette henholdsvis) for at frembringe en homogen cellesuspension til galvanisering, der indeholder ca. 70% Sertoliceller. Efter 3 dage i kultur, ved hjælp af et medium, der er serumfrit, procentdelen af ​​Sertoli celler stiger til ca. 90%. Dette kunne især tilskrives en død kontaminerende kimceller. Resterende peritubulære celler (PTC), dog holde solidt fastgjort via deres ekstracellulære matrix. PTC'er, men ikke Sertoli celler, vides at producerefibronectin, der kan tjene som markør-protein til estimering kontaminering med PTC'er. Derfor Tung et al. ræsonnerede, at en yderligere hyaluronidase behandling kan forbedre renheden af Sertolicellen fraktion ^7. Faktisk kunne de vise, at en yderligere behandling kunne reducere forurening med PTC'er ca. 20-fold, som bliver særlig tydeligt, når et serum-holdigt medium i sammenligning anvendes til dyrkning af oprensede Sertoliceller. Fra da af den forbedrede procedure for Tung et al. blev den fremherskende protokol og blev flittigt brugt af andre større grupper på området ⁸ (figur 1B).

Under collagenasebehandling flertallet af PTC'er frigives og kan isoleres parallelt med Sertoliceller. Ud fra følgende betragtninger PTC'er kraftigt formere og reagerer ikke på follikelstimulerende hormon (FSH), behøver Sertoliceller ikke undergår mitose længere, og reagere på FSH ved karakteristiske morfologiske ændringerog en stigning i cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP) koncentration ^9. Meget lignende enzymatisk nedbrydning protokoller kan anvendes til isolering af primære Sertoliceller fra andre dyr som mennesket ^10, muse ^11,12, sibirisk hamster ^{13 eller} yak ^14. Til fjernelse af store mængder forurenende kønsceller en hypotonisk chok kan anvendes ved afslutningen af den isolation procedure ^15. Dette muliggør også en effektiv isolering af Sertoliceller fra voksen rotte testikler ^16. En beriget Sertolicellen suspension kan også separeres fra kimceller ved udpladning af suspensionen på lectin retter overtrukket med Datura stramonium agglutinin ^17. Kun Sertoliceller og et par resterende PTC'er overholde lectin plader.

Primær Sertoli cellekulturer, hovedsageligt fra rotten, er oprindeligt brugt til undersøgelse lydhørhed over for hormoner eller oprettelse cellelinjer som muse Sertolicellen line TM4 ^18. Denne cellelinie er blevet undersøgt i mere end hundrede studier frem til i dag. I en translationel tilgang Sertoliceller er blevet brugt til immun-beskyttelse af co-dyrkede celler og væv som i co-transplantation af fremmedfjendske eller allogene pancreas-øer for langsigtet graftoverlevelse uden systemisk immunosuppression ^19. Isolerede Sertoli-celler er også blevet anvendt i co-kultur eksperimenter til undersøgelse epitel-mesenkymale (Sertoliceller – PTCc) og somatisk-kønsceller (Sertoliceller – kimceller) interaktioner ^{20, 21.} Senest primære Sertoliceller er blevet anvendt til undersøgelse af ekspression af Toll-lignende receptorer og sekretionen af proinflammatoriske cytokiner samt signaltransduktionsegenskaberne kaskader fører til cytokinekspression efter infektion med patogene og uropatogen E. coli ^22. Andre nylige undersøgelser brugte Sertoliceller for at studere testikelkræft immun privilege ²³ og viste, at testosteron-forbehandling undertrykker LPS-inducerede inflammatoriske respons ^24.

Protocol

1. Dyreetiske Statement Eksperimenter er beskrevet her, blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Regierungspräsidium Giessen, Tyskland, som den lokale myndighed og bekræft til den tyske adfærdskodeks for pasning og anvendelse af dyr til forsøg (Tilladelse nr.: GI 20/23 Nr A 31 / 2012). 2. Udarbejdelse af Medier, enzymløsninger og Dyr Forberede 1% jod alkohol ved at opløse 1 g iod i 100 ml ethanol. Forbered 2x 500 ml Dulbecco phosphatbufret saltv…

Representative Results

Den beskrevne procedure tillader isolering af det ca. 12 x 10 7 Sertoli celler fra 10 rotte testikler. 3 x 10 6 celler udplades per brønd på en 6-brønds plade, således at seks til syv plader med 6 brønde er tilgængelige for eksperimenter på dag 7. Den trypsin-DNase I fordøjelsen er den mest kritiske trin under Sertolicellen isolation. Hvis fordøjelse på dette tidspunkt skrider for langt, er forholdet mellem kønsceller / Sertoliceller vil uforholdsmæssigt…

Discussion

The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, wh…

Materials

Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4	Dako	M0851	Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized	Serva	11930.04	Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence.
Corning™ Cell Strainers 70 µm	Corning	431751	White color
Collagenase A from Clostridium histolyticum	Roche	10103586001
DAPI mountant ProLong® Gold Antifade	Life technologies	P-36931
D-glucose	Sigma	G8644	100 g/l
Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+	Gibco	14190-094
DNase I	Roche	10104159001
Electron microscope	Zeiss	EM 109S
Fluorescence microscope	Zeiss	Axioplan 2
Hyaluronidase from bovine testis	Sigma	H3506
Inverted light microscope	Olympus	CKX41	Routine cell culture microscope
Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody	Life technologies	A-10684	Alexa Fluor® 488 conjugate
Oil Red O	Sigma	O0625	Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml)	Gibco	15070-063	100x solution
RPMI-1640	Gibco	21875-034	Contains 300 mg/L L-glutamine
Trypsin from porcine pancreas	Sigma	T5266
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T6522	The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche.
Vimentin antibody (V9)	Sigma	V6630	Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.  Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Wistar WU rats	Charles River	N/A	Should be 19 days old on day of experiment.