Isolatie van Sertoli cellen en peritubulaire Cellen van Rat Testikels
Summary
Primaire Sertoli cellen nodig zijn voor het bestuderen van testis-immune privilege, signaaltransductie tijdens ontsteking of infectie, en het gebruik van hun immunobeschermende eigenschappen. Hier beschrijven we een enzym-gebaseerd protocol voor de isolatie van zeer zuivere primaire Sertoli cellen en peritubulaire cellen van ratten testes.
Abstract
De testis, en met name de mannelijke gameten, daagt het immuunsysteem op een unieke manier, omdat gedifferentieerd sperma eerst verschijnen op het moment van de puberteit – meer dan tien jaar na de oprichting van de systemische immunologische tolerantie. Spermatogenese cellen brengen een aantal eiwitten die kunnen worden beschouwd als niet-zelf door het immuunsysteem. De testis moet dan in staat zijn tolerantie vast te stellen die neo-antigenen enerzijds maar nog steeds in staat om zich tegen infecties en tumorontwikkeling anderzijds. Daarom is de testis is een van de weinige immune bevoorrechte plaatsen in het lichaam die vreemde antigenen tolereren zonder nadelig roepen inflammatoire immuunrespons. Sertoli cellen spelen een belangrijke rol voor het onderhoud van deze immuun bevoorrechte omgeving van de testis en ook de overleving van cotransplanted cellen te verlengen in een vreemde omgeving. Daarom primaire Sertoli cellen zijn een belangrijk instrument voor het bestuderen van het immuunsysteem voorrecht van de testis die niet kan worden easily vervangen door gevestigde cellijnen of andere cellulaire modellen. Hier presenteren we een gedetailleerde en uitgebreide protocol voor de isolatie van Sertoli cellen – en peritubulaire cellen indien gewenst – van rat testes binnen een enkele dag.
Introduction
Testikels produceren mannelijke gameten en geslachtshormonen, dat wil zeggen, androgenen. Het orgaan bestaat uit twee compartimenten. In de interstitiële compartiment, dat vertegenwoordigt ongeveer 10-12% van de totale testis volume 1, steroidogenesis plaatsvindt binnen de Leydigcellen. De buisvormige compartiment vertegenwoordigt ongeveer 60-80% van de testiculaire volume 1 en bevat kiemcellen en twee typen somatische cellen – peritubulaire cellen en Sertoli-cellen. De testis wordt gedeeld door bindweefsel septa in 250-300 lobben, elk met 1-3 zeer ingewikkelde testes. Deze buisjes worden omsloten door een basaal membraan, een vel collageen en een omtreks- laag peritubulaire cellen (Figuur 1A).
De kiemepitheel ligt aan de luminale zijde van het basale membraan. Sertoli cellen zijn grote langgerekte cellen die de gehele germinal epithelium van de basale membraan naar het lumen overspannen. Ze zijn sterk attdeed pijn aan de basale membraan en vormen een continue cellulaire vel door middel van basolaterale georganiseerd tight junctions dat de germinal epitheel afsluit van het interstitium en vertegenwoordigt de bloed-testis barrière. Sertoli cellen hebben prominente cytoplasmische projecties en vertakkingen die hen in staat stellen om in strakke morfologische en functionele contact met een soortspecifieke, maar constant aantal kiemcellen. Diploïde germinal stamcellen vermenigvuldigen en differentiëren tot spermatogonia.
Tijdens meiose I kortstondige tetraploïde spermatocyten worden gegenereerd die tijdens de meiose II verder in vier haploïde spermatiden ontwikkelen. Alle kiemcellen zijn verbonden door cytoplasmatische bruggen zodat zij een cellulair netwerk. De belangrijkste gebeurtenis tijdens rijping van spermatiden is de extrusie van grote delen van het cytoplasma, vorming resterende organen, in een proces genaamd spermiogenese. Resterende organen gefagocyteerd door Sertoli-cellen. Late spermatiden worden dan vrijgelaten inhet buisvormige lumen en getransporteerd naar de bijbal verdere rijping. Sertoli cellen en kiemcellen lijken onderling te coördineren spermatogenese topografisch en functioneel.
Voorbereiding van de individuele testis celtypen begon bijna een eeuw geleden, toen kleine testikels stukken werden geteeld en celtypen geïdentificeerd door microscopie 2. Door een zorgvuldige dissectie van de buisjes na opening van de tunica albuginea met behulp van fijne punt tang was het later mogelijk om tubulaire en interstitiële compartimenten 3 scheiden. In 1975 Welsh Wiebe introduceerde een collagenase behandeling om de tubuli te bevrijden hechten bindweefsel en pancreatine behandeling voor het verwijderen van de buitenste cellaag peritubulaire 4. Al vroeg jonge onvolwassen ratten (ongeveer 20 dagen oud) werden gebruikt waarbij de Sertoli cellen een groot deel van de buisvormige celpopulatie omdat spermatogenese nog niet begonnen. Op deze leeftijd rat SertOli cellen ophouden te verdelen, en strakke verbindingen tussen naburige cellen vormen zodat het bloed-testis barrière is vastgesteld 5.
Onafhankelijk van het Welsh en Wiebe Dorrington et al., Introduceerde een combinatie van trypsine en Deoxyribonuclease gevolgd door soybeen trypsine-remmer en collagenase behandeling die in hetzelfde jaar 6 werd gepubliceerd. Beide groepen ook mechanische kracht (trekken van het buisvormige gedigereerde fragmenten herhaaldelijk door een naald of een Pasteur pipet respectievelijk) om een homogene celsuspensie te plateren dat ongeveer 70% Sertoli cellen bevat te produceren. Na 3 dagen kweken met behulp van een medium dat serumvrij het percentage Sertoli-cellen verhoogt tot ongeveer 90%. Dit kan grotendeels worden toegeschreven aan de dood van verontreinigende kiemcellen. Peritubulaire resterende cellen (PTC), maar blijven stevig bevestigd via hun extracellulaire matrix. PTCs, maar niet Sertoli cellen, bekend producerenfibronectine dat als een marker eiwit kan dienen voor het schatten van verontreiniging met PTC's. Daarom Tung et al. gemotiveerd een extra hyaluronidase behandeling de zuiverheid van de Sertoli celfractie 7 kunnen verbeteren. Inderdaad konden aantonen dat een aanvullende behandeling kon verontreiniging met PTC ongeveer 20-voudig te verminderen, die vooral duidelijk wordt wanneer vergeleken een serumbevattend medium gebruikt wordt voor het kweken van gezuiverde Sertoli cellen. Van toen af aan de verbeterde werkwijze van Tung et al. werd de heersende protocol en is intensief gebruikt door andere grote groepen in het gebied 8 (figuur 1B).
Tijdens collagenase behandeling de meeste PTC vrij en kunnen parallel worden geïsoleerd om Sertoli cellen. Overwegende dat de PTC krachtig laten groeien en niet reageren op de follikel stimulerend hormoon (FSH), Sertoli cellen niet meer mitose ondergaan en te reageren op FSH door karakteristieke morfologische veranderingenen een verhoging van cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP) concentratie 9. Vergelijkbaar enzymatische digestie protocollen kunnen worden gebruikt voor het isoleren van primaire Sertoli cellen van andere dieren zoals man 10, 11,12 muis, hamster Siberische 13 of 14 Jak. Voor het verwijderen van grote hoeveelheden contaminerende kiemcellen een hypotone schok worden gebruikt aan het einde van de isolatiewerkwijze 15. Dit maakt ook de efficiënte isolatie van Sertoli cellen uit volwassen ratten testes 16. Een verrijkte Sertoli cel suspensie kan ook uit kiemcellen worden gescheiden door plating de schorsing op lectine gerechten bedekt met Datura Stramonium agglutinine 17. Slechts Sertoli cellen en enkele resterende PTCs zich aan het lectine platen.
Primaire Sertoli celculturen, voornamelijk uit de rat, zijn in eerste instantie gebruikt voor het onderzoeken van respons op hormonen of oprichting van cellijnen, zoals de muis Sertoli cel line TM4 18. Deze cellijn werd onderzocht in meer dan honderd studies tot op heden. In een translationele benadering zijn Sertoli-cellen werden gebruikt voor immuno-bescherming van co-gekweekte cellen en weefsels, zoals in het co-transplantatie van vreemdelingenhaat of allogene pancreaseilandjes langdurige transplantaatoverleving zonder systemische immunosuppressie 19. Geïsoleerde Sertoli cellen zijn ook gebruikt in co-kweek-experimenten voor het bestuderen van epitheliale-mesenchymale (Sertoli cellen – PTCC) en somatische-kiemcellen (Sertoli cellen – kiemcellen) interacties 20, 21. Onlangs primaire Sertoli cellen zijn toegepast voor het onderzoeken van de expressie van Toll-achtige receptoren en de secretie van pro-inflammatoire cytokines en de signaaltransductie cascades die tot uitdrukking cytokine na infectie met pathogene en uropathogene E. 22 coli. Andere recente onderzoeken werden met behulp van Sertoli cellen voor het bestuderen van de testis immuun privilege 23 en aangetoond dat testosteron voorbehandeling onderdrukt de LPS-geïnduceerde ontstekingsreactie 24.
Protocol
Representative Results
Discussion
The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, wh…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag bedanken Guido Verhoeven en Ludo Deboel, Leuven, die was zeer behulpzaam bij het vaststellen van de isolatie van primaire Sertoli cellen in het lab Meinhardt in Giessen waren. Monika Fijak, Gießen, is erkend voor haar hulp met figuur 1A en advies. Studies werden ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft door middel van subsidie BH 93 / 1-1 (SB) en de financiering van het International Research Graduate College JLU Gießen (Duitsland) / Monash University (Melbourne, Australië) GRK 1871 (SB). Ondersteuning werd ook verkregen uit een subsidie van de staat van Hessen binnen het programma "Landes-Offensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) genaamd "männliche Infertilität bei Infektion & Entzündung" (MIBIE).
Materials
| Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4 | Dako | M0851 | Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized |
Serva | 11930.04 | Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence. |
| Corning™ Cell Strainers 70 µm | Corning | 431751 | White color |
| Collagenase A from Clostridium histolyticum | Roche | 10103586001 | |
| DAPI mountant ProLong® Gold Antifade | Life technologies | P-36931 | |
| D-glucose | Sigma | G8644 | 100 g/l |
| Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14190-094 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Electron microscope | Zeiss | EM 109S | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan 2 | |
| Hyaluronidase from bovine testis | Sigma | H3506 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX41 | Routine cell culture microscope |
| Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody |
Life technologies | A-10684 | Alexa Fluor® 488 conjugate |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml) |
Gibco | 15070-063 | 100x solution |
| RPMI-1640 | Gibco | 21875-034 | Contains 300 mg/L L-glutamine |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma | T5266 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche. |
| Vimentin antibody (V9) | Sigma | V6630 | Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Wistar WU rats | Charles River | N/A | Should be 19 days old on day of experiment. |
References
- Nieschlag, E., Behre, H., Nieschlag, S. . Andrology. Male Reproductive Health and Dysfunction. , (2010).
- Esaki, S. Über Kulturen des Hodengewebes der Säugetiere und über die Natur des interstitiellen Hodengewebes und der Zwischenzellen. Z. Mikrosk. Anat. Forsch. 15, 368-404 (1928).
- Hall, P. F., Irby, D. C., De Kretser, D. M. Conversion of cholesterol to androgens by rat testes: comparison of interstitial cells and seminiferous tubules. Endocrinology. 84, 488-496 (1969).
- Welsh, M. J., Wiebe, J. P. Rat sertoli cells: a rapid method for obtaining viable cells. Endocrinology. 96, 618-624 (1975).
- Vitale, R., Fawcett, D. W., Dym, M. The normal development of the blood-testis barrier and the effects of clomiphene and estrogen treatment. Anat. Rec. 176, 331-344 (1973).
- Dorrington, J. H., Roller, N. F., Fritz, I. B. Effects of follicle-stimulating hormone on cultures of Sertoli cell preparations. Mol. Cell. Endocrinol. 3, 57-70 (1975).
- Tung, P. S., Skinner, M. K., Fritz, I. B. Fibronectin synthesis is a marker for peritubular cell contaminants in Sertoli cell-enriched cultures. Biol. Reprod. 30, 199-211 (1984).
- Verhoeven, G., Cailleau, J. Testicular peritubular cells secrete a protein under androgen control that inhibits induction of aromatase activity in Sertoli cells. Endocrinology. 123, 2100-2110 (1988).
- Tung, P. S., Dorrington, J. H., Fritz, I. B. Structural changes induced by follicle-stimulating hormone or dibutyryl cyclic AMP on presumptive Sertoli cells in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72, 1838-1842 (1975).
- Teng, Y., et al. Isolation and culture of adult Sertoli cells and their effects on the function of co-cultured allogeneic islets in vitro. Chin. Med. J. (Engl.). 118, 1857-1862 (2005).
- Kohno, S., Ziparo, E., Marek, L. F., Tung, K. S. Murine Sertoli cells: major histocompatibility antigens and glycoconjugates. J. Reprod. Immunol. 5, 339-350 (1983).
- Dufour, J. M., et al. Sertoli cell line lacks the immunoprotective properties associated with primary Sertoli cells. Cell Transplant. 17, 525-534 (2008).
- Majumdar, S. S., Tsuruta, J., Griswold, M. D., Bartke, A. Isolation and culture of Sertoli cells from the testes of adult Siberian hamsters: analysis of proteins synthesized and secreted by Sertoli cells cultured from hamsters raised in a long or a short photoperiod. Biol. Reprod. 52, 658-666 (1995).
- Zhang, H., Liu, B., Qiu, Y., Fan, J., Yu, S. Pure cultures and characterization of yak Sertoli cells. Tissue Cell. 45, 414-420 (2013).
- Ziparo, E., Geremia, R., Russo, M. A., Stefanini, M. Surface interaction in vitro between Sertoli cells and germ cells at different stages of spermatogenesis. Am. J. Anat. 159, 385-388 (1980).
- Anway, M. D., Folmer, J., Wright, W. W., Zirkin, B. R. Isolation of Sertoli cells from adult rat testes: an approach to ex vivo studies of Sertoli cell function. Biol. Reprod. 68, 996-1002 (2003).
- Scarpino, S., et al. A rapid method of Sertoli cell isolation by DSA lectin, allowing mitotic analyses. Mol. Cell. Endocrinol. 146, 121-127 (1998).
- Mather, J. P. Establishment and characterization of two distinct mouse testicular epithelial cell lines. Biol. Reprod. 23, 243-252 (1980).
- Korbutt, G. S., Elliott, J. F., Rajotte, R. V. Cotransplantation of allogeneic islets with allogeneic testicular cell aggregates allows long-term graft survival without systemic immunosuppression. Diabetes. 46, 317-322 (1997).
- Fritz, I. B. Somatic cell-germ cell relationships in mammalian testes during development and spermatogenesis. Ciba Found. Symp. 182, 271-281 (1994).
- Whaley, P. D., Chaudhary, J., Cupp, A., Skinner, M. K. Role of specific response elements of the c-fos promoter and involvement of intermediate transcription factor(s) in the induction of Sertoli cell differentiation (transferrin promoter activation) by the testicular paracrine factor PModS. Endocrinology. 136, 3046-3053 (1995).
- Bhushan, S., et al. Uropathogenic Escherichia coli block MyD88-dependent and activate MyD88-independent signaling pathways in rat testicular cells. J. Immunol. 180, 5537-5547 (2008).
- Meinhardt, A., Hedger, M. P. Immunological, paracrine and endocrine aspects of testicular immune privilege. Mol. Cell. Endocrinol. 335, 60-68 (2011).
- Fijak, M., et al. Influence of Testosterone on Inflammatory Response in Testicular Cells and Expression of Transcription Factor Foxp3 in T Cells. Am. J. Reprod. Immunol. , 12-25 (2015).
- Mamidi, M. K., et al. Impact of passing mesenchymal stem cells through smaller bore size needles for subsequent use in patients for clinical or cosmetic indications. J. Transl. Med. 10, 229 (2012).
- Ito, S., Karnovsky, M. J. Formaldehyde-glutaraldehyde fixatives containing trinitro compounds. J. Cell. Biol. 39, 168-169 (1968).
- Galdieri, M., Ziparo, E., Palombi, F., Russo, M. A., Stefanini, M. Pure Sertoli cell cultures: a new model for the study of somatic-germ cell interactions. J. Androl. 5, 249-254 (1981).
- Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunol. Rev. 213, 66-81 (2006).
- Jegou, B. The Sertoli cell in vivo and in vitro. Cell Biol. Toxicol. 8, 49-54 (1992).
- Pineau, C., Le Magueresse, B., Courtens, J. L., Jegou, B. Study in vitro the phagocytic function of Sertoli cells in the rat. Cell Tissue Res. 264, 589-598 (1991).
- Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5, 563-568 (1998).
- Ducray, A., et al. Establishment of a mouse Sertoli cell line producing rat androgen-binding protein (ABP). Steroids. 63, 285-287 (1998).
- Konrad, L., et al. Rat Sertoli cells express epithelial but also mesenchymal genes after immortalization with SV40. Biochim. Biophys. Acta. 1722, 6-14 (2005).
