चूहा वृषण से Sertoli कोशिकाओं के अलगाव और Peritubular प्रकोष्ठों
Summary
प्राथमिक Sertoli कोशिकाओं में सूजन या संक्रमण, और उनके immunoprotective गुण के उपयोग के दौरान वृषण-प्रतिरक्षा विशेषाधिकार, संकेत पारगमन के अध्ययन के लिए आवश्यक हैं। यहाँ हम उच्च शुद्ध प्राथमिक Sertoli कोशिकाओं और चूहे वृषण से peritubular कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक एंजाइम आधारित प्रोटोकॉल का वर्णन है।
Abstract
वृषण, और विशेष रूप से नर युग्मक में, एक अनोखा तरीका में प्रतिरक्षा प्रणाली को चुनौती दी है क्योंकि भेदभाव शुक्राणु पहले यौवन के समय में दिखाई देते हैं – दस साल से अधिक प्रणालीगत प्रतिरक्षा सहिष्णुता की स्थापना के बाद। स्पेर्मेटोजेनिक कोशिकाओं प्रोटीन है कि गैर आत्म प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा के रूप में देखा जा सकता है की एक संख्या व्यक्त करते हैं। वृषण तो एक हाथ पर इन नव-एंटीजन को सहिष्णुता स्थापित करने के लिए है, लेकिन अभी भी खुद को दूसरी ओर संक्रमण और ट्यूमर के विकास से बचाने के लिए सक्षम हो सक्षम होना चाहिए। इसलिए वृषण शरीर में कुछ विशेषाधिकार प्राप्त प्रतिरक्षा साइटों है कि एक हानिकारक भड़काऊ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया evoking बिना विदेशी एंटीजन बर्दाश्त से एक है। Sertoli कोशिकाओं वृषण के इस विशेषाधिकार प्राप्त प्रतिरक्षा पर्यावरण के रखरखाव के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और यह भी एक विदेशी माहौल में cotransplanted कोशिकाओं के अस्तित्व को लम्बा खींच। इसलिए प्राथमिक Sertoli कोशिकाओं वृषण ई नहीं है कि हो सकता है की प्रतिरक्षा विशेषाधिकार के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैasily स्थापित सेल लाइनों या अन्य सेलुलर मॉडल के द्वारा बदल दिया। और peritubular कोशिकाओं वांछित है – – चूहे वृषण से एक ही दिन के भीतर यहाँ हम Sertoli कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विस्तृत और व्यापक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।
Introduction
वृषण पुरुष युग्मक और यौन हार्मोन, यानी, एण्ड्रोजन का उत्पादन। अंग दो डिब्बों से बना है। मध्य डिब्बे में, कि, कुल वृषण मात्रा 1 के बारे में 10-12% का प्रतिनिधित्व करता steroidogenesis लेडिग की कोशिकाओं के भीतर जगह लेता है। ट्यूबलर डिब्बे वृषण मात्रा 1 के 60-80% के बारे में प्रतिनिधित्व करता है और रोगाणु कोशिकाओं और दैहिक कोशिकाओं के दो प्रकार के होते हैं – peritubular कोशिकाओं और Sertoli कोशिकाओं। वृषण 250-300 lobules में संयोजी ऊतक सेप्टा से विभाजित है, प्रत्येक 1-3 अत्यधिक जटिल बीजदार नलिकाओं से युक्त। इन नलिकाओं एक बेसल झिल्ली, कोलेजन के एक पत्रक, और peritubular कोशिकाओं की एक परत परिधीय (चित्रा 1 ए) द्वारा संलग्न हैं।
कीटाणु उपकला बेसल झिल्ली की luminal ओर स्थित है। Sertoli कोशिकाओं बड़ी लम्बी कोशिकाओं कि लुमेन के लिए बेसल झिल्ली से पूरे कीटाणु उपकला अवधि रहे हैं। वे दृढ़ता हैं एटीटीबेसल झिल्ली के लिए बैठ जाता है और उस interstitium से कीटाणु उपकला occludes और रक्त-वृषण बाधा का प्रतिनिधित्व करता है basolateral संगठित तंग जंक्शनों के माध्यम से एक सतत सेलुलर चादर के रूप में। Sertoli कोशिकाओं प्रमुख cytoplasmic अनुमानों और असर है कि उन्हें जनन कोशिकाओं की एक प्रजाति विशेष लेकिन लगातार संख्या के साथ तंग रूपात्मक और कार्यात्मक संपर्क में पाने के लिए सक्षम है। द्विगुणित कीटाणु स्टेम कोशिकाओं को पैदा करना और शुक्राणुजन में अंतर है।
अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान मैं टेट्राप्लोइड spermatocytes उत्पन्न कर रहे हैं कि अर्धसूत्रीविभाजन II के दौरान चार अगुणित spermatids में आगे विकसित अल्पकालिक। सभी जनन कोशिकाओं cytoplasmic पुलों से जुड़े रहते हैं ताकि वे एक सेलुलर शुद्ध फार्म रहे हैं। spermatids की परिपक्वता के दौरान प्रिंसिपल घटना, अवशिष्ट निकायों के गठन, एक प्रक्रिया बुलाया spermiogenesis में कोशिका द्रव्य के बड़े हिस्से से बाहर निकालना है। अवशिष्ट शव Sertoli कोशिकाओं द्वारा phagocytosed रहे हैं। देर spermatids फिर में जारी कर रहे हैंट्यूबलर लुमेन और आगे की परिपक्वता के लिए अधिवृषण में पहुँचाया। Sertoli कोशिकाओं और रोगाणु कोशिकाओं परस्पर भौगोलिक विवरण और कार्यात्मक spermatogenesis समन्वय करने के लिए दिखाई देते हैं।
अलग-अलग वृषण सेल प्रकार की तैयारी लगभग एक सदी पहले शुरू हुई जब छोटे टुकड़े वृषण खेती की जाती थी और सेल प्रकार माइक्रोस्कोपी 2 द्वारा की पहचान की। ठीक इत्तला दे दी संदंश का उपयोग Tunica धवल खोलने के बाद नलिकाओं से सावधान विच्छेदन के द्वारा यह संभव हो गया था बाद में ट्यूबलर और मध्य डिब्बों 3 अलग करने के लिए। 1975 में वेल्श और Wiebe मध्य ऊतक और बाहरी peritubular सेल परत 4 को हटाने के लिए एक pancreatin उपचार पालन करने से नलिकाओं को मुक्त करने के क्रम में एक कोलैजिनेज़ उपचार की शुरुआत की। क्योंकि spermatogenesis अभी तक शुरू नहीं हुई है से जल्दी जवान अपरिपक्व चूहों पर (वर्ष 20 के आसपास दिन) में जो इस्तेमाल किया गया था Sertoli कोशिकाओं ट्यूबलर सेल की आबादी का एक बड़ा अंश शामिल हैं। इस उम्र चूहे Sert परओली कोशिकाओं के विभाजन के लिए संघर्ष, और पड़ोसी कोशिकाओं के बीच तंग जंक्शनों के लिए फार्म ताकि रक्त-वृषण बाधा 5 की स्थापना की है।
वेल्श और Wiebe Dorrington एट अल। के स्वतंत्र trypsin का एक संयोजन पेश किया है और deoxyribonuclease soybeen trypsin अवरोध और collagenase उपचार है कि इसी वर्ष 6 में प्रकाशित किया गया था द्वारा पीछा किया। दोनों समूहों को भी आदेश लगभग 70% Sertoli कोशिकाओं होता है कि चढ़ाना के लिए एक सजातीय सेल निलंबन का उत्पादन करने में यांत्रिक बल (एक सिरिंज सुई या एक पाश्चर विंदुक क्रमशः के माध्यम से बार बार पच ट्यूबलर टुकड़े ड्राइंग) का इस्तेमाल किया। संस्कृति में 3 दिन, एक माध्यम है कि सीरम मुक्त है उपयोग करने के बाद, Sertoli कोशिकाओं का प्रतिशत लगभग 90% तक बढ़ जाती है। यह काफी हद तक जनन कोशिकाओं contaminating की मौत के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। अवशिष्ट peritubular कोशिकाओं (पीटीसी), तथापि, दृढ़ता से अपने बाह्य मैट्रिक्स के माध्यम से संलग्न रहते हैं। पीटीसी, लेकिन नहीं Sertoli कोशिकाओं, उत्पादन करने के लिए जाना जाता हैफ़ाइब्रोनेक्टिन कि पीटीसी के साथ संदूषण का आकलन करने के लिए एक मार्कर प्रोटीन के रूप में सेवा कर सकते हैं। इसलिए, तुंग एट अल। तर्क है कि एक अतिरिक्त hyaluronidase उपचार Sertoli सेल अंश 7 की शुद्धता में सुधार हो सकता है। वास्तव में वे दिखा सकता है कि एक अतिरिक्त उपचार पीटीसी द्वारा प्रदूषण को कम करने के लिए लगभग 20 गुना है, जो विशेष रूप से स्पष्ट हो जाता है जब तुलना में एक सीरम युक्त मध्यम शुद्ध Sertoli कोशिकाओं की खेती के लिए प्रयोग किया जाता है में सक्षम था। तब से तुंग एट अल के सुधार प्रक्रिया पर। प्रचलित प्रोटोकॉल बन गया है और बड़े पैमाने पर क्षेत्र 8 (चित्रा 1 बी) में अन्य प्रमुख समूहों द्वारा इस्तेमाल किया गया था।
कोलैजिनेज़ उपचार के दौरान पीटीसी के बहुमत जारी कर रहे हैं और Sertoli कोशिकाओं के समानांतर में अलग किया जा सकता है। जबकि पीटीसी सख्ती पैदा करना और कूप उत्तेजक हार्मोन (FSH) का जवाब नहीं है, Sertoli कोशिकाओं अब बँटवारा गुजरना नहीं है और विशेषता रूपात्मक परिवर्तन से एफएसएच का जवाबऔर चक्रीय adenosine monophosphate (शिविर) 9 एकाग्रता में वृद्धि हुई है। इसी तरह बहुत enzymatic पाचन प्रोटोकॉल आदमी 10, 11,12 माउस, साइबेरियाई हम्सटर 13 या 14 याक की तरह अन्य जानवरों से प्राथमिक Sertoli कोशिकाओं के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। रोगाणु कोशिकाओं को एक hypotonic सदमे contaminating की बड़ी मात्रा को हटाने के लिए अलगाव की प्रक्रिया 15 के अंत में नियोजित किया जा सकता है। वयस्क चूहे से 16 वृषण यह भी Sertoli कोशिकाओं के कुशल अलगाव की अनुमति देता है। एक समृद्ध Sertoli सेल निलंबन भी नशा एक प्रकार का धतूरा साथ agglutinin 17 लेपित लेक्टिन बर्तन पर निलंबन चढ़ाना द्वारा जनन कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है। केवल Sertoli कोशिकाओं और कुछ अवशिष्ट पीटीसी लेक्टिन प्लेटों का पालन करें।
प्राथमिक Sertoli सेल संस्कृतियों, मुख्य रूप से चूहे से, हार्मोन के लिए जवाबदेही की जांच कर या माउस Sertoli सेल ली तरह सेल लाइनों की स्थापना के लिए शुरू में इस्तेमाल किया गया हैne TM4 18। यह सेल लाइन एक सौ से अधिक अध्ययनों में आज तक जांच की गई है। एक translational दृष्टिकोण में Sertoli कोशिकाओं प्रणालीगत प्रतिरक्षादमन 19 बिना सह सुसंस्कृत कोशिकाओं और लंबी अवधि के भ्रष्टाचार के अस्तित्व के लिए xeno- या अनुवांशिक रूप से भिन्न अग्नाशय टापू के सह-प्रत्यारोपण में जैसे ऊतकों के इम्युनो-संरक्षण के लिए उपयोग किया गया है। और दैहिक-रोगाणु सेल (Sertoli कोशिकाओं – रोगाणु कोशिकाओं) बातचीत 20, 21 – पृथक Sertoli कोशिकाओं को भी उपकला-mesenchymal (PTCc Sertoli कोशिकाओं) के अध्ययन के लिए सह संस्कृति प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया है। हाल ही में प्राथमिक Sertoli कोशिकाओं टोल की तरह रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति और proinflammatory साइटोकिन्स के स्राव के साथ ही संकेत पारगमन झरने की जांच nonpathogenic और uropathogenic ई के साथ संक्रमण के बाद अभिव्यक्ति साइटोकाइन के लिए अग्रणी के लिए नियोजित किया गया है कोलाई 22। हाल के अन्य जांच वृषण प्रतिरक्षा पी के अध्ययन के लिए Sertoli कोशिकाओं का उपयोग कर रहे थेrivilege 23 और दिखा दिया कि टेस्टोस्टेरोन पूर्व उपचार LPS प्रेरित भड़काऊ प्रतिक्रिया 24 को रोकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, wh…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों गुइडो वर्होएवन और लूडो Deboel, लोवेन, जो Giessen में Meinhardt प्रयोगशाला में प्राथमिक Sertoli कोशिकाओं के अलगाव स्थापित करने में बेहद मददगार थे शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। मोनिका Fijak, Giessen, चित्रा 1 ए और सलाह के साथ उसकी मदद के लिए स्वीकार किया है। अध्ययन अनुदान बिहार 93 / 1-1 (एसबी) और अंतरराष्ट्रीय अनुसंधान स्नातकोत्तर महाविद्यालय JLU Gießen (जर्मनी) / मोनाश विश्वविद्यालय (मेलबोर्न, ऑस्ट्रेलिया) GRK 1,871 (एसबी) के धन के माध्यम से ड्यूश Forschungsgemeinschaft द्वारा समर्थित थे। समर्थन भी कार्यक्रम 'लैंडेस आक्रामक सूर Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz "(LOEWE)" Männliche Infertilität bei Infektion और Entzündung "(MIBIE) नामक भीतर हेसन के राज्य का अनुदान से प्राप्त हुई थी।
Materials
| Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4 | Dako | M0851 | Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized |
Serva | 11930.04 | Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence. |
| Corning™ Cell Strainers 70 µm | Corning | 431751 | White color |
| Collagenase A from Clostridium histolyticum | Roche | 10103586001 | |
| DAPI mountant ProLong® Gold Antifade | Life technologies | P-36931 | |
| D-glucose | Sigma | G8644 | 100 g/l |
| Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14190-094 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Electron microscope | Zeiss | EM 109S | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan 2 | |
| Hyaluronidase from bovine testis | Sigma | H3506 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX41 | Routine cell culture microscope |
| Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody |
Life technologies | A-10684 | Alexa Fluor® 488 conjugate |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml) |
Gibco | 15070-063 | 100x solution |
| RPMI-1640 | Gibco | 21875-034 | Contains 300 mg/L L-glutamine |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma | T5266 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche. |
| Vimentin antibody (V9) | Sigma | V6630 | Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Wistar WU rats | Charles River | N/A | Should be 19 days old on day of experiment. |
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