쥐 고환의 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 분리 및 세뇨관 세포
Summary
차 세르 톨리 (Sertoli) 세포는 면역 보호 특성의 염증이나 감염, 및 이용 기간 동안 고환 면역 특권, 신호 전달 연구가 필요합니다. 여기에서 우리는 고도로 정제 차 세르 톨리 (Sertoli) 세포와 쥐의 고환에서 세뇨관 세포의 분리를 위해 효소 기반의 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
분화는 정자 제 사춘기시 나타나는 때문에 정소, 특히 남성 생식에서 독특한 방식으로 면역계 도전 – 10 년 이상의 전신성 면역 관용의 확립 후. 정자 세포는 면역 체계에 의해 비 자동으로 알 수있는 단백질의 수를 표현한다. 정소는 한 손이 네오 항원 내성을 확립 여전히 한편 감염 및 종양 발생으로부터 자신을 보호 할 수 있어야한다. 따라서 고환은 유해한 염증 면역 반응을 불러 일으키는없이 외국 항원을 허용 몸에 약간의 면역 특권 사이트 중 하나입니다. 세르 톨리 세포 고환이 면역 특권 환경 유지에 중요한 역할을하며 외부 환경 cotransplanted 세포의 생존을 연장. 따라서 차 세르 톨리 (Sertoli) 세포는 전자가 될 수 없습니다 고환의 면역 특권을 연구하기위한 중요한 도구입니다asily 설립 세포주 또는 다른 세포 모델로 대체. 원하는 경우 세뇨관 세포 – – 쥐의 고환에서 하루 내에 여기에서 우리는 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 분리에 대한 상세하고 포괄적 인 프로토콜을 제시한다.
Introduction
고환은 안드로겐을 즉 남성 생식 및 성 호르몬을 생산하고 있습니다. 기관은 두 개의 구획으로 구성되어있다. 간질 성 구획에서, 즉 스테로이드는 간질 세포 내에서 발생, 총 고환 볼륨 1의 10-12 %를 차지. 관형 구획 고환 부피의 약 1 60-80%를 나타내고, 생식 세포 및 체세포 두 종류 포함 – 세뇨관 세포와 버팀 세포. 정소는 각각 1-3 고도로 복잡한 정소 세관을 포함 250-300 소엽으로 결합 조직 중격에 의해 분할된다. 이 세관은 기초 막, 콜라겐 시트 및 세뇨관 세포의 원주 층 (그림 1A)에 의해 둘러싸인.
새싹 상피 세포가 기저막의 내강 측에 있습니다. 세르 톨리 세포 루멘 기저막에서 전체 종자 상피 걸쳐 큰 신장 세포이다. 그들은 강하게 아르 AT & T는기초 막에 아팠다과 간질에서 생식 상피를 폐색 및 혈액 – 고환 장벽을 나타내는 기저 조직 꽉 접합을 통해 지속적인 세포 시트를 형성한다. 세르 톨리 세포는 눈에 띄는 세포질 계획과 생식 세포의 종 특이하지만 상수와 꽉 형태 학적 및 기능적 접촉 얻을 할 수 있도록 파급 효과가있다. 배체 생식 줄기 세포는 증식과 정조 세포로 분화.
감수 분열 동안 나는 감수 분열 II 동안 추가로 네 개의 반수체 정자에 개발 생성 배체 정모 세포를 짧은 살았다. 그들이 셀룰러 망을 형성하도록 모든 생식 세포 세포질 브릿지로 연결된다. 정자 성숙 동안 주요 이벤트 spermiogenesis 불리는 과정에서 잔류 체를 형성 세포질의 대부분의 압출이다. 잔류 몸은 세르 톨리 (Sertoli) 세포에 의해 포식한다. 늦은 정자는 다음에 출시관 루멘은 더욱 성숙 부고환으로 이송. 세르 톨리 세포와 생식 세포 상호 지형적 기능적으로 정자를 조정하기 위해 나타납니다.
작은 고환 조각이 재배 및 세포 유형은 현미경 (2)에 의해 확인 된 경우 개별 고환 세포 유형의 준비는 거의 한 세기 전에 시작했다. 뾰족한 집게를 사용의 Tunica albuginea을 연 후 세관의주의 해부으로는 관과 간질 구획 (3)를 분리 이후 수 있었다. 1975 년 웨일스어 및 위브는 간질 조직과 외부 세뇨관 세포 층 (4)의 제거를위한 크레아틴 처리를 부착 세관을 확보하기 위해 콜라게나 제 처리를 도입했다. 초기 젊은 미성숙 래트에 대한 (오래된 약 20 일)이되는 사용되었던에서 정자가 아직 시작되지 않았으므로 세르 톨리 세포 튜브형 세포 집단의 많은 부분을 포함한다. 이 연령 쥐 르트에서OLI 세포는 분열을 중단하고, 혈액 – 고환 장벽 (5)를 설립되도록 인접 셀 간의 긴밀한 접합을 형성한다.
웨일스어 및 위브 Dorrington 외.의 독립은 트립신의 조합을 소개하고, 같은 해 6 년에 출판되었다 soybeen 트립신 억제제와 콜라게나 제 처리하여 디옥시리보 뉴 클레아. 두 그룹은 약 70 %의 Sertoli 세포를 포함 도금 균질 세포 현탁액을 제조하기 위해 (주사기 바늘 또는 각각 파스퇴르 피펫을 통하여 반복해서 분해 관형 단편 드로잉) 기계적 힘을 사용했다. 혈청이없는 배지를 사용하여 배양 3 일 후, 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 비율은 약 90 %로 증가한다. 이것은 주로 생식 세포 오염의 죽음에 기인 할 수있다. 잔류 세뇨관 세포 (PTCS)은, 그러나, 그들의 세포 외 기질 단단히 통해 부착있어. PTCS 아니지만 세르 톨리 (Sertoli) 세포를 생성하는 것으로 알려진PTCS 오염을 추정하기위한 마커 단백질로서 작용할 수 피브로넥틴. 따라서, 오동 나무 등. 추가 히알루 처리 세르 톨리 세포 분획 (7)의 순도를 개선시킬 수 있음을 추론. 실제로 이들은 추가적인 처리에 비해 혈청 함유 배지 정제 세르 톨리 (Sertoli) 세포 배양에 사용되는 경우에 특히 분명하게되는 약 20 배 PTCS에 의한 오염을 줄일 수있는 것을 표시 할 수있다. 그때부터 오동 나무 등의 등의 개선 된 절차에. 일반적인 프로토콜되었고 광범위 필드 8 (그림 1B)의 다른 주요 그룹에 의해 사용되었다.
콜라게나 제 처리 중에 PTCS의 대부분이 해제되고 버팀 세포에 병렬로 분리 될 수있다. PTCS가 적극적으로 증식과 난포 자극 호르몬 (FSH)이 응답하지 않는 반면, 세르 톨리 (Sertoli) 세포는 더 이상 분열을 겪게 및 특성 형태 학적 변화에 의해 FSH에 반응하지 않는및 환상 아데노신 모노 포스페이트 (cAMP) 농도 9 증가한다. 매우 유사한 효소 소화 프로토콜 남자 10, 11, 12, 마우스, 햄스터 시베리아 13 야크 (14)와 같은 다른 동물 차 세르 톨리 세포의 분리를 위해 사용될 수있다. 생식 세포를 저장성 충격 오염 다량 제거하기위한 분리 절차 (15)의 단부에 사용될 수있다. 성인 쥐 16 고환에서 이것은 또한 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 효율적인 분리를 허용한다. 농축 버팀 세포 현탁액은 계시 가시 독말풀과 응집소 17 렉틴 코팅 접시에 현탁액을 도금함으로써 세균 세포로부터 분리 될 수있다. 만 세르 톨리 (Sertoli) 세포와 약간의 잔류 PTCS는 렉틴 판에 부착.
기본 버팀 세포 배양 주로 쥐에서 마우스 세르 톨리 (Sertoli) 세포 리튬 등 세포주 호르몬 반응성을 조사하거나 설정하기위한 초기 사용되고네브라스카 TM4 18. 이 세포주는 지금까지 이상 백 연구에서 조사되었다. 병진 접근법에서 세르 톨리 세포 면역 조직 (19)없이 공 배양 세포 및 장기 이식 생존 동종 또는 이종의 췌장의 공동 이식에서와 같은 조직의 면역 보호에 이용되고있다. 체세포 – 생식 세포 (세르 톨리 (Sertoli) 세포 – 생식 세포) (20)의 상호 작용 21 – 격리 버팀 세포는 상피 간엽 (PTCc 세르 톨리 (Sertoli) 세포) 공부 공동 배양 실험에 사용되었다. 최근 주 버팀 세포 비병원성과 uropathogenic E. 감염 다음 식 사이토 카인 선도 수신자 같은 수용체의 발현 및 염증성 사이토 카인의 분비뿐만 아니라 신호 전달 캐스케이드 조사에 이용되고 대장균 22. 다른 최근 조사는 고환 면역 쪽을 공부 세르 톨리 (Sertoli) 세포를 사용 하였다rivilege (23)과 테스토스테론 전처리가 LPS에 의한 염증 반응 (24)을 억제 것을 보여 주었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, wh…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 기센의 마인 하르트 실험실에서 차 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 분리를 확립 매우 도움이되었다 귀도 베르 호벤과 루 Deboel, 루벤을, 감사의 말씀을 전합니다. 모니카 Fijak, 기센은 그림 1A와 조언으로 그녀의 도움을 인정 받고 있습니다. 연구는 국제 연구 대학원 대학 JLU 기센 (독일) / 모나 쉬 대학 (호주 멜버른) GRK 1871 (SB)의 보조금 BH 93 / 1-1 (SB)와 자금 조달을 통해 독일 연구 협회에 의해 지원되었다. 지원은 "Männliche Infertilität BEI Infektion & Entzündung"(MIBIE)라는 프로그램 "랜디스 – 공격 주르 ENTWICKLUNG Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz"(LOEWE) 내에서 헤센의 국가의 보조금로부터 얻은 것입니다.
Materials
| Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4 | Dako | M0851 | Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized |
Serva | 11930.04 | Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence. |
| Corning™ Cell Strainers 70 µm | Corning | 431751 | White color |
| Collagenase A from Clostridium histolyticum | Roche | 10103586001 | |
| DAPI mountant ProLong® Gold Antifade | Life technologies | P-36931 | |
| D-glucose | Sigma | G8644 | 100 g/l |
| Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14190-094 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Electron microscope | Zeiss | EM 109S | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan 2 | |
| Hyaluronidase from bovine testis | Sigma | H3506 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX41 | Routine cell culture microscope |
| Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody |
Life technologies | A-10684 | Alexa Fluor® 488 conjugate |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml) |
Gibco | 15070-063 | 100x solution |
| RPMI-1640 | Gibco | 21875-034 | Contains 300 mg/L L-glutamine |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma | T5266 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche. |
| Vimentin antibody (V9) | Sigma | V6630 | Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Wistar WU rats | Charles River | N/A | Should be 19 days old on day of experiment. |
References
- Nieschlag, E., Behre, H., Nieschlag, S. . Andrology. Male Reproductive Health and Dysfunction. , (2010).
- Esaki, S. Über Kulturen des Hodengewebes der Säugetiere und über die Natur des interstitiellen Hodengewebes und der Zwischenzellen. Z. Mikrosk. Anat. Forsch. 15, 368-404 (1928).
- Hall, P. F., Irby, D. C., De Kretser, D. M. Conversion of cholesterol to androgens by rat testes: comparison of interstitial cells and seminiferous tubules. Endocrinology. 84, 488-496 (1969).
- Welsh, M. J., Wiebe, J. P. Rat sertoli cells: a rapid method for obtaining viable cells. Endocrinology. 96, 618-624 (1975).
- Vitale, R., Fawcett, D. W., Dym, M. The normal development of the blood-testis barrier and the effects of clomiphene and estrogen treatment. Anat. Rec. 176, 331-344 (1973).
- Dorrington, J. H., Roller, N. F., Fritz, I. B. Effects of follicle-stimulating hormone on cultures of Sertoli cell preparations. Mol. Cell. Endocrinol. 3, 57-70 (1975).
- Tung, P. S., Skinner, M. K., Fritz, I. B. Fibronectin synthesis is a marker for peritubular cell contaminants in Sertoli cell-enriched cultures. Biol. Reprod. 30, 199-211 (1984).
- Verhoeven, G., Cailleau, J. Testicular peritubular cells secrete a protein under androgen control that inhibits induction of aromatase activity in Sertoli cells. Endocrinology. 123, 2100-2110 (1988).
- Tung, P. S., Dorrington, J. H., Fritz, I. B. Structural changes induced by follicle-stimulating hormone or dibutyryl cyclic AMP on presumptive Sertoli cells in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72, 1838-1842 (1975).
- Teng, Y., et al. Isolation and culture of adult Sertoli cells and their effects on the function of co-cultured allogeneic islets in vitro. Chin. Med. J. (Engl.). 118, 1857-1862 (2005).
- Kohno, S., Ziparo, E., Marek, L. F., Tung, K. S. Murine Sertoli cells: major histocompatibility antigens and glycoconjugates. J. Reprod. Immunol. 5, 339-350 (1983).
- Dufour, J. M., et al. Sertoli cell line lacks the immunoprotective properties associated with primary Sertoli cells. Cell Transplant. 17, 525-534 (2008).
- Majumdar, S. S., Tsuruta, J., Griswold, M. D., Bartke, A. Isolation and culture of Sertoli cells from the testes of adult Siberian hamsters: analysis of proteins synthesized and secreted by Sertoli cells cultured from hamsters raised in a long or a short photoperiod. Biol. Reprod. 52, 658-666 (1995).
- Zhang, H., Liu, B., Qiu, Y., Fan, J., Yu, S. Pure cultures and characterization of yak Sertoli cells. Tissue Cell. 45, 414-420 (2013).
- Ziparo, E., Geremia, R., Russo, M. A., Stefanini, M. Surface interaction in vitro between Sertoli cells and germ cells at different stages of spermatogenesis. Am. J. Anat. 159, 385-388 (1980).
- Anway, M. D., Folmer, J., Wright, W. W., Zirkin, B. R. Isolation of Sertoli cells from adult rat testes: an approach to ex vivo studies of Sertoli cell function. Biol. Reprod. 68, 996-1002 (2003).
- Scarpino, S., et al. A rapid method of Sertoli cell isolation by DSA lectin, allowing mitotic analyses. Mol. Cell. Endocrinol. 146, 121-127 (1998).
- Mather, J. P. Establishment and characterization of two distinct mouse testicular epithelial cell lines. Biol. Reprod. 23, 243-252 (1980).
- Korbutt, G. S., Elliott, J. F., Rajotte, R. V. Cotransplantation of allogeneic islets with allogeneic testicular cell aggregates allows long-term graft survival without systemic immunosuppression. Diabetes. 46, 317-322 (1997).
- Fritz, I. B. Somatic cell-germ cell relationships in mammalian testes during development and spermatogenesis. Ciba Found. Symp. 182, 271-281 (1994).
- Whaley, P. D., Chaudhary, J., Cupp, A., Skinner, M. K. Role of specific response elements of the c-fos promoter and involvement of intermediate transcription factor(s) in the induction of Sertoli cell differentiation (transferrin promoter activation) by the testicular paracrine factor PModS. Endocrinology. 136, 3046-3053 (1995).
- Bhushan, S., et al. Uropathogenic Escherichia coli block MyD88-dependent and activate MyD88-independent signaling pathways in rat testicular cells. J. Immunol. 180, 5537-5547 (2008).
- Meinhardt, A., Hedger, M. P. Immunological, paracrine and endocrine aspects of testicular immune privilege. Mol. Cell. Endocrinol. 335, 60-68 (2011).
- Fijak, M., et al. Influence of Testosterone on Inflammatory Response in Testicular Cells and Expression of Transcription Factor Foxp3 in T Cells. Am. J. Reprod. Immunol. , 12-25 (2015).
- Mamidi, M. K., et al. Impact of passing mesenchymal stem cells through smaller bore size needles for subsequent use in patients for clinical or cosmetic indications. J. Transl. Med. 10, 229 (2012).
- Ito, S., Karnovsky, M. J. Formaldehyde-glutaraldehyde fixatives containing trinitro compounds. J. Cell. Biol. 39, 168-169 (1968).
- Galdieri, M., Ziparo, E., Palombi, F., Russo, M. A., Stefanini, M. Pure Sertoli cell cultures: a new model for the study of somatic-germ cell interactions. J. Androl. 5, 249-254 (1981).
- Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunol. Rev. 213, 66-81 (2006).
- Jegou, B. The Sertoli cell in vivo and in vitro. Cell Biol. Toxicol. 8, 49-54 (1992).
- Pineau, C., Le Magueresse, B., Courtens, J. L., Jegou, B. Study in vitro the phagocytic function of Sertoli cells in the rat. Cell Tissue Res. 264, 589-598 (1991).
- Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5, 563-568 (1998).
- Ducray, A., et al. Establishment of a mouse Sertoli cell line producing rat androgen-binding protein (ABP). Steroids. 63, 285-287 (1998).
- Konrad, L., et al. Rat Sertoli cells express epithelial but also mesenchymal genes after immortalization with SV40. Biochim. Biophys. Acta. 1722, 6-14 (2005).
