Isolering av Sertoliceller och peritubulär Celler från Rat Testiklar

Summary

Primära Sertoliceller krävs för att studera testikel-immun privilegium, signaltransduktion under inflammation eller infektion, och utnyttjande av deras immun egenskaper. Här beskriver vi en enzym-baserat protokoll för isolering av höggradigt renade primära Sertoliceller och peritubulära celler från rått testiklar.

Abstract

Testiklarna, och i synnerhet hangamet utmanar immunsystemet på ett unikt sätt, eftersom differentierade spermier först visas vid tidpunkten för puberteten – mer än tio år efter införandet av systemisk immuntolerans. Spermatogenescykler celler uttrycker ett antal proteiner som kan ses som icke-själv av immunsystemet. Testiklarna måste då kunna etablera tolerans mot dessa neo-antigener, å ena sidan, men ändå kunna skydda sig mot infektioner och tumörutveckling å andra sidan. Därför testiklarna är en av ett fåtal immun privilegierade platser i kroppen som tål främmande antigener utan att framkalla en skadlig inflammatorisk immunsvar. Sertoliceller spelar en nyckelroll för upprätthållandet av detta immun privilegierad miljö av testiklarna och även förlänga överlevnaden av cotransplanted celler i en främmande miljö. Därför primära Sertoliceller är ett viktigt verktyg för att studera immun förmånen att testikeln som inte kan vara easily ersättas med etablerade cellinjer eller andra cellulära modeller. Här presenterar vi en detaljerad och omfattande protokoll för isolering av Sertoliceller – och peritubulära celler om så önskas – från rått testiklar i en enda dag.

Introduction

Testiklarna producerar manliga könsceller och könshormoner, det vill säga, androgener. Orgeln är sammansatt av två avdelningar. I interstitialrummet representerar att ungefär 10-12% av den totala testikelvolym ^1, steroid sker inom Leydigceller. Det rörformiga facket utgör ungefär 60-80% av den testikelvolymen ¹ och innehåller könsceller och två typer av somatiska celler – peritubulära celler och Sertoliceller. Testiklarna delas av bindväv septa i 250-300 lobules, vardera innehållande 1-3 mycket invecklade sädeskanalerna. Dessa tubuli är omslutna av en basal membran, ett ark av kollagen, och ett periferiskikt av peritubulära celler (Figur 1A).

Den germinala epitel är belägen på den luminala sidan av basalmembranet. Sertoliceller är stora avlånga celler som spänner över hela embryon epitel från basalmembranet till lumen. De är starkt ATTvärkte till basalmembranet och bildar en sammanhängande cellulär ark genom basolaterala organiserade tight junctions som täpper till stilbildande epitel från interstitium och representerar blodtestikelbarriären. Sertoliceller har framträdande cytoplasmiska utsprång och förgreningar som gör det möjligt för dem att komma in i tät morfologiska och funktionella kontakt med en artspecifik men konstant antal könsceller. Diploida embryon stamceller föröka sig och differentierar till spermatogonier.

Under meios I kortlivade tetraploida spermatocyter genereras som utvecklas ytterligare i fyra haploida spermatider under meios II. Alla könsceller är sammankopplade genom cytoplasmatiska bryggor så att de bildar ett cellulärt nät. Den huvudsakliga händelse under mognaden av spermatider är extrudering av stora delar av cytoplasman och bildar resterande organ, i en process som kallas spermiogenesen. Rest kroppar fagocyteras av Sertoliceller. Sena spermatider frigörs sedan in ide rörformiga lumen och transporteras till bitestiklarna för ytterligare mognad. Sertoliceller och könsceller verkar ömsesidigt samordna spermatogenes topografiskt och funktionellt.

Framställning av enskilda testikelcelltyper började nästan ett sekel sedan när små testikel bitar odlades och celltyper identifieras genom mikroskopi ^2. Genom noggrann dissektion av tubuli efter öppning tunica albuginea använder spetsig pincett var det senare möjligt att separera rörformiga och mellanliggande fack ^3. 1975 introducerade Welsh och Wiebe en kollagenasbehandling för att befria de tubuli från att vidhäfta interstitiell vävnad och en pankreatin behandling för avlägsnande av den yttre peritubulära cellskiktet ^4. Från tidigt unga omogna råttor (cirka 20 dagar gamla) hade använts i vilken Sertolicellerna utgör en stor del av den rörformiga cellpopulationen eftersom spermatogenes inte har börjat ännu. I den här åldern råtta Sertoli-celler att upphöra att dela sig, och tight junctions mellan grannceller bildar så att blod-testikelbarriären är etablerad ^5.

Oberoende av Welsh och Wiebe Dorrington et al. Infört en kombination av trypsin och deoxiribonukleas följt av soybeen trypsininhibitor och kollagenas behandling som publicerades samma år ^6. Båda grupperna har också använt mekanisk kraft (ritning de spjälkade tubulära fragment upprepade gånger genom en sprutnål eller en pasteurpipett respektive) i syfte att producera en homogen cellsuspension för plätering som innehåller cirka 70% Sertoliceller. Efter 3 dagar i odling, med användning av ett medium som är serumfritt, ökar den procentuella andelen av Sertoliceller till cirka 90%. Detta kan till stor del hänföras till döden av kontaminerande könsceller. Rest peritubulära celler (PTC), dock hålla stadigt fastsatt via deras extracellulära matrisen. PTC, men inte Sertoliceller, är kända för att producerafibronektin som kan fungera som ett markörprotein för att uppskatta förorening med PTC. Därför Tung et al. motiverat att en ytterligare hyaluronidas behandling kan förbättra renheten av Sertoli cellfraktionen ^7. I själva verket kunde de visa att en ytterligare behandling kunde minska föroreningen av PTC cirka 20 gånger, vilket blir särskilt tydligt när i jämförelse ett seruminnehållande medium används för odling renade Sertoliceller. Från och med då det förbättrade förfarandet enligt Tung et al. blev den rådande protokollet och i stor utsträckning används av andra stora grupper inom ^åtta (Figur 1B).

Under kollagenas behandling majoriteten av PTC frigörs och kan isoleras i parallellt med Sertoliceller. Medan PTC kraftigt föröka och inte svarar på follikelstimulerande hormon (FSH), do Sertoliceller inte genomgå mitos längre och svara på FSH genom karakteristiska morfologiska förändringaroch en ökning av cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) koncentration ^9. Mycket liknande enzymatiska digereringsprotokoll kan användas för isolering av primära Sertoliceller från andra djur som människa ^10, mus ^11,12, sibirisk hamster ¹³ eller jak ^14. För avlägsnande av stora mängder av kontaminerande könsceller en hypoton chock kan användas vid slutet av isoleringsförfarandet ^15. Detta gör också att en effektiv isolering av Sertoliceller från vuxen råtta testiklar ^16. En berikad Sertolicellen suspension kan också separeras från könsceller genom plätering av suspensionen på lektin skålar belagda med Datura stramonium-agglutinin ^17. Endast Sertoliceller och några rest PTC följa lektin plattorna.

Primär Sertoli cellkulturer, främst från råtta har använts initialt för att undersöka känslighet för hormoner eller upprättandet cellinjer som mus Sertolicellen line TM4 ^18. Denna cellinje har undersökts i mer än hundra studier fram till idag. I en translationell tillvägagångssätt Sertoliceller har använts för immunskydd av samodlade celler och vävnader som i co-transplantation av främlings- eller allogena pankreasöar för långsiktig graft överlevnad utan systemisk immunsuppression ^19. Isolerade Sertoliceller har också använts i samarbete kultur experiment för att studera epitel-mesenkymala (Sertoliceller – PTCc) och somatisk-könsceller (Sertoliceller – könsceller) interaktioner ^{20, 21.} Nyligen primära Sertoliceller har använts för att undersöka uttryck av Toll-liknande receptorer och utsöndringen av proinflammatoriska cytokiner liksom signaltransduktionskaskader leder till cytokinexpression efter infektion med icke-patogena och uropatogen E. coli ^22. Andra nya undersökningar använde Sertoliceller för att studera testikelimmun privilege ²³ och visade att testosteron förbehandling undertrycker LPS-inducerad inflammatoriskt svar ^24.

Protocol

1. Animal Ethics Statement Experiment som beskrivs här utfördes enligt riktlinjer Regierungspräsidium Giessen, Tyskland, som kommunen och bekräfta den tyska uppförandekoden för skötsel och användning av djur för försöksändamål (Tillstånd nr. GI 20/23 Nr A 31 / 2012). 2. Beredning av Media, Enzymlösningar och djur Bered 1% jod alkohol genom att lösa 1 g jod i 100 ml etanol. Förbereda 2x 500 ml Dulbecco's fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan <su…

Representative Results

Den beskrivna proceduren tillåter isolering av ca 12 x 10 7 Sertoliceller från 10 rått testiklar. 3 x 10 6 celler stryks per brunn på en 6-brunnsplatta så att sex till sju 6-brunnars plattor är tillgängliga för experiment på dag 7. Trypsin-DNas I digerering är det mest kritiska steget under Sertoli cellisolering. Om nedbrytning vid denna punkt går framåt för långt, förhållandet mellan könsceller / Sertoliceller kommer oproportionerligt öka fram til…

Discussion

The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, wh…

Materials

Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4	Dako	M0851	Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized	Serva	11930.04	Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence.
Corning™ Cell Strainers 70 µm	Corning	431751	White color
Collagenase A from Clostridium histolyticum	Roche	10103586001
DAPI mountant ProLong® Gold Antifade	Life technologies	P-36931
D-glucose	Sigma	G8644	100 g/l
Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+	Gibco	14190-094
DNase I	Roche	10104159001
Electron microscope	Zeiss	EM 109S
Fluorescence microscope	Zeiss	Axioplan 2
Hyaluronidase from bovine testis	Sigma	H3506
Inverted light microscope	Olympus	CKX41	Routine cell culture microscope
Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody	Life technologies	A-10684	Alexa Fluor® 488 conjugate
Oil Red O	Sigma	O0625	Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml)	Gibco	15070-063	100x solution
RPMI-1640	Gibco	21875-034	Contains 300 mg/L L-glutamine
Trypsin from porcine pancreas	Sigma	T5266
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T6522	The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche.
Vimentin antibody (V9)	Sigma	V6630	Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.  Use 1:100 dilution for immunofluorescence.
Wistar WU rats	Charles River	N/A	Should be 19 days old on day of experiment.