Fizyolojik Yanıtları Ölçüm<em> Drosophila</em> Canlı Kalsiyum Görüntüleme kullanma Lipit Feromonlar Sensory Nöronlar
Summary
The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.
Abstract
Memeliler aksine, örneğin Drosophila olarak böcekler birden tat organları vardır. Bacaklar, burnumun, kanat ve Drosophila ovipositor üzerine nöronların tat reseptörleri 1,2, iyon kanalları 3-6 ve uçucu ve uçucu olmayan duyusal ipuçlarının saptanmasında katılan iyonotropik reseptörler 7 ifade eder. Bu nöronlar doğrudan gıda, zararlı maddeler ve feromonlar gibi tat yoğunluğu arttırıcı başvurun ve bu nedenle bu tür beslenme, yumurtlama ve çiftleşme gibi birçok karmaşık davranışlar etkilemektedir. Elektrot kayıtları ve kalsiyum görüntüleme yaygın olarak bu tat yoğunluğu arttırıcı tarafından uyarılmış nöronal yanıtları ölçmek için böcekler kullanılmaktadır. Ancak, elektrofizyoloji hücre tipi, boyutu ve konumuna bağlı olarak teknik olarak zor olabilir, tek bir tat Sensillum gelen özel ekipman ve elde ölçümleri gerektirir. Buna ek olarak, Drosophila tek nöron çözünürlüğü tat Sensilla hou beri elde etmek zor olabilirkimyasal duyu nöron se birden fazla türü. Burada anlatılan canlı kalsiyum görüntüleme yöntemi canlı sinekler tek tat nöronların yanıtları ölçülecek sağlar. Bu yöntem, su bazlı çözücüler içinde düşük çözünürlüğe sahip, lipid feromonlar ve diğer ligand türlerine nöronal yanıtları görüntüleme için özellikle uygundur.
Introduction
Hayvanlar hayatta kalma ve üreme için gerekli kararları arabuluculuk koku ve tat bilgilere güveniyor. Algılanabilir ve sinir sistemi tarafından nasıl işlendiğini kimyasal duyu ipuçları anlama duyu reseptör (ler) ve karşılık gelen kimyasal ligand tanımlanmasını gerektirir., Drosophila uçucu ve uçucu olmayan bileşiklerin şaşırtıcı bir dizi tespit etmek ve fizyolojik olarak incelenmesi için mükemmel bir modeldir mekanizmalar chemosensation altında yatan. koku organları uçucu moleküller algıladıkları iken, tat organları düşük volatilite bileşikleri tespit etmek için uzman bulunmaktadır. Burada, doğrudan düşük volatilite, lipofilik ligandlara Drosophila melanogaster tat organlarından nöronal tepkilerini ölçmek için bir yöntem mevcut.
sinek tat organları kol, burnumun ve kanatları dahil. s yanıt Sensilla olarak bilinen saç benzeri yapılar tat organları yüzeyi üzerinde dağıtılırugars, bitters, tuzlar, su ve feromonlar 8. Sensilla tat kıllar içine morfolojik tasnif edilmiş ve tat 9 mandal. uzun (L-tip) sınıflandırılır labellum yaklaşık 31 tat kılların kısa (S-tipi) ve ara madde (I-tipi) morfolojileri vardır. Şeker fizyolojik yanıt 'L' ve 'S' Sensilla evi 4 duyu nöronları (S hücresi), düşük tuzlu (L1 hücresi), tuz ve acı bileşikleri (L2 hücre) ve su (W hücresi) 10 11. Diğer cevaplarından ise yüksek tuz 12 düşük tuz ve şeker hem tepki biri 'i Sensilla evi 2 duyusal nöronlar,. erkeklerde yaklaşık 41 tat Sensilla ve Ön ayakların her dağıtılmış kadınlarda 26 Sensilla vardır. Her iki erkek ve kadınlarda, midleg 21 Sensilla ve hindleg 13 yaklaşık 22 Sensilla vardır. ayakları üzerinde tat Sensilla çevrili tat nöronlar da c vardırL1, L2, W ve S tipe lassified.
tek nöronların elektrik aktivitesini ölçmek için bir standart yöntem iyon akışını kaydetmek için hücre dışı ya da hücre içi elektrotlar kullanır. Elektrot ölçümleri nöronal fonksiyonu, Drosophila türüne, kelebekler ve nöral etiketleme için geniş genetik araçları yoksun arılar gibi non-model organizmaların incelenmesi gereken sağlar. Elektrofizyolojik yöntemler rutin bu yaklaşımı uygulayarak, 4,13,14 Sensilla Drosophila tadı aktivitesini ölçmek için kullanılır olmuştur Bununla birlikte, birçok teknik zorluklar getirmektedir. İlk olarak, kıllar morfolojisi ve uzamsal yere göre tespit edilmesi gerekir tadı. kimlik üzerine, elektrofizyolojik ölçümler, Sensilla küçük boyutu ile engellenmiş olabilir pozisyona bağlı erişilebilirlik sınırlıdır ve bir tat kimyasal uyarıcı kontrollü hacimleri uygulayarak zorluk kıl. Ayrıca, Sensilla uyarılması birden fazla sinyal oluşturabilirnöronal tip 15. İkinci olarak, elektrik sinyallerinin tespiti elektronik cihazların mekanik titreşim ve gürültü kaynaklanan arka plan gürültüsünü tarafından eleştirilmiştir olabilir. Yanlış 14 kullanıldığı takdirde Üçüncü olarak, bir bilenmiş elektrodun kullanılması, sinek hazırlık zarar verebilir. Son olarak, bir elektrofizyoloji teçhizat montaj uyaran teslim sinyal kayıt ve veri analizi için özel elektronik bileşenleri gerektirir ve masraflı olabilir.
D. melanogaster, genetik olarak kodlanmış araçların kullanılabilirliği nöronların küçük popülasyonlarının yanıtları okudu izin görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesini kolaylaştırmıştır. Bu tür bir yaklaşım CaLexA raportör 16 kullanımıdır. Bu yöntemde, LexA-VP16 transkripsiyon faktörü ve kalsiyuma duyarlı bir protein NFAT kodlayan gen dizileri birbirine birleştirilir. protein fosfataz calcineurin'in kalsiyum aktivasyon dönüş, facilita içinde, NFAT de-fosforilasyon katalize veçekirdeğin içine ithal TES. çekirdeğin içinde, LexA alan, böylece, işlevsel aktif nöronların sürekli teşhisine izin veren, yeşil flüoresan proteini (GFP) raportörün ifadesini yöneten bir LexAOp-DNA bağlanma motifi ile bağlanır. Yaklaşım odorant 16 canlı sinek maruz kaldıktan sonra antennal lobda özel koku glomerulusların tepkisini ölçmek için başarıyla kullanılmaktadır. Son zamanlarda, IR52c tat reseptör nöronların fizyolojik yanıtlar CaLexA 7 kullanılarak canlı sinekler ölçüldü. 6 haftaya kadar GFP transkripsiyonu geliştirmek için Ancak, bu çalışma için, bu yaş sinekler gerekliydi. Bir anti-GFP antikoruyla immün CaLexA sinyali artırmak için kullanılabilir, ancak bu durumda, yöntem, canlı hücre görüntüleme olasılığını engelleyen, doku fiksasyon gerektirir.
genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi proteini GCaMP da kapsamlı bir dizi nöronal yanıtları incelemek için kullanılmıştırtürler 17. Protein GCaMP nöronal uyarım önce düşük yoğunluklu fluoresces. Uyarıcı uygulanması Ca2 + akışı ile sonuçlanır nöron bir eylem potansiyeli tetikler. Ca + 2 bağlı GCaMP, bu daha parlak yoğunluk (Şekil 1) ile floresan neden konformasyonel değişime uğrar. Son yıllarda geliştirilmiş olan tek nöron kalsiyum görüntüleme yaklaşımı ön ayağı belirli bir Gr61a tat nöronlar 18 için ligand olarak glükoz tespit etmek için kullanıldı. Bu çalışmada, Gr61a tat nöronlarda GCaMP eksprese Drosophila kesilerek ön bacakları görüntüleme önce agaroz tabakası ile kaplanmıştır. Bununla birlikte, kesilerek doku kullanımı, böylece ölçüm süresi ve saptama hassasiyetini sınırlayıcı GCaMP ifade nihai özet neden olabilir. Buna ek olarak, agaroz, yüksek floresan arka plan seviyeleri ve ışık saçma özelliklerine duyarlılık sınırlayabilir.
To Bu sakıncalardan bazılarının ele, biz ön ayağın ve burnumun bozulmamış hayvanların tat nöronlar gelen fizyolojik yanıtları kaydetmek için GCaMP aracılı kalsiyum görüntüleme kullanımını tarif eder. Biz, bir Drosophila lipit feromon genetik olarak kodlanmış GCaMP5G 19 ifade eden fizyolojik Gr68a cevaplan ve ppk23 nöronlar, (3R, 11 Z, 19 Z) -3-asetoksi-11,19-octacosadien-1-ol (CH503), 20 göstermektedir 21. Nöronal tepkiler feromon uyarımı esnasında GCaMP5G sinyalinin floresanstaki artışı miktarının ile ölçülür. Bu protokolde, nöronlar bireysel hücrelerin nöronal aktivasyon kalıplarını ayırt etmek yeterlidir 120 sn, toplam süresi görüntülenmiş.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz burada 2 farklı duyu organları Drosophila periferik nöronların canlı kalsiyum görüntüleme gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ca + 2 CH503 doza bağımlı ve nicel olduğu feromon ligand ile uyarılan Gr68a-nöronlarda GCaMP fluoresan yanıt -evoked. Böyle fazik ve tonik yanıtlar gibi farklı nöral yanıt desenleri ayırt etmek de mümkündü.
Fazik tepkiler gösteren nöronlar sürekli uyaranlara hızlı uyum sağlamak olduğuna inanıl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).
Materials
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287, 1830-1834 (2000).
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell Rep. 1, 599-607 (2012).
- Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity. PLoS Genet. 10, 1004238 (2014).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors. Neuron. 83, 850-865 (2014).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).
- Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).
- Rodrigues, V., Siddiqi, O. A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors. Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).
- Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J. Vis. Exp. , e51355 (2014).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).
- Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor. J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).
- Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons. PloS One. 8, e56304 (2013).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Shikichi, Y., et al. Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers. Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).
- Yew, J. Y., et al. A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila. Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).
- Bray, S., Amrein, H. A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship. Neuron. 39, 1019-1029 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance. Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).
- Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).
- Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems. Front Neurosci. 4, 53 (2010).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Busch, K. E., et al. Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state. Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).
