La medición de las respuestas fisiológicas de<em> Drosophila</em> Las neuronas sensoriales a los lípidos feromonas Uso de Imagen de calcio en Vivo
Summary
The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.
Abstract
A diferencia de los mamíferos, insectos, tales como Drosophila tienen múltiples órganos del gusto. Las neuronas quimiosensriales en las piernas, trompa, las alas y ovipositor de Drosophila expresan receptores gustativos 1,2 canales iónicos, 3-6, y los receptores ionotrópicos 7 que están involucrados en la detección de señales sensoriales volátiles y no volátiles. Estas neuronas en contacto directamente con estimulantes del gusto tales como alimentos, sustancias nocivas y las feromonas y por lo tanto influyen muchos comportamientos complejos tales como la alimentación, la puesta de huevos y el apareamiento. grabaciones de electrodos y de imágenes de calcio se han usado ampliamente en los insectos para cuantificar las respuestas neuronales evocadas por estos estimulantes del gusto. Sin embargo, la electrofisiología requiere un equipo especializado y las mediciones de obtener de una sola sensillum sabor puede ser técnicamente difícil dependiendo del tipo de células, tamaño y posición. Además, la resolución de la neurona individual en Drosophila puede ser difícil de lograr ya que Hou sabor sensillase más de un tipo de neurona quimiosensorial. El método de formación de imágenes en vivo de calcio descrito aquí permite respuestas de las neuronas gustativas individuales en moscas vivas que han de medirse. Este método es especialmente adecuado para obtener imágenes de las respuestas neuronales a las feromonas de lípidos y otros tipos de ligandos que tienen baja solubilidad en disolventes a base de agua.
Introduction
Los animales dependen de la información olfativa y gustativa para mediar en las decisiones esenciales para la supervivencia y la reproducción. La comprensión de cómo las señales chemosensory se detectan y procesan por el sistema nervioso requiere la identificación del receptor (s) sensorial y los correspondientes ligandos químicos. Drosophila detectar una asombrosa variedad de compuestos volátiles y no volátiles y son un excelente modelo en el que estudiar la fisiológico mecanismos que subyacen chemosensation. Mientras que los órganos olfativos perciben moléculas volátiles, los órganos gustativos están especializados para detectar compuestos de baja volatilidad. A continuación, presentamos un método para medir directamente las respuestas neuronales a partir de los órganos del gusto de Drosophila melanogaster a baja volatilidad, los ligandos lipofílicos.
órganos gustativos de la marcha incluyen las patas delanteras, trompa, y las alas. Distribuida en la superficie de los órganos del gusto son estructuras similares a pelos conocidos como sensilla que responden a sugars, amargos, sales, agua y feromonas 8. El sensilla han sido clasificadas morfológicamente en cerdas de sabor y gusto clavijas 9. Hay alrededor de 31 cerdas gustativas en el labelo, que se clasifican en el (tipo L) de largo, corto (de tipo s) y morfologías intermedias (de tipo I). Sensilla casa 4 neuronas sensoriales de los 'l' y 's' que responden fisiológicamente al azúcar (la celda S), bajas en sal (la celda L1), alto contenido de sal y compuestos amargos (la celda L2) y agua (la célula W) 10 , 11. La "i" casa 2 neuronas sensoriales sensilla, uno de los cuales responde tanto a baja en sal y azúcar, mientras que el otro responde a alta concentración de sal 12. Hay aproximadamente 41 sensilla gusto en los hombres y 26 en las mujeres sensilla distribuidos en cada una de las patas delanteras. Por tanto machos como hembras, hay 21 sensilla en el midleg, y alrededor del 22 sensilla en la pata trasera 13. Las neuronas gustativas cerrados por la sensilla gusto en las piernas también son classified en tipos L1, L2, W y S.
Un método estándar para medir la actividad eléctrica de las neuronas individuales utiliza electrodos extracelulares o intracelulares para grabar el flujo de iones. Mediciones de electrodos permiten la función neuronal que se estudiará en organismos modelo tales como especies de Drosophila, polillas y abejas que carecen de amplias herramientas genéticas para el etiquetado de los nervios. Sin embargo, mientras que los métodos electrofisiológicos se han utilizado habitualmente para medir la actividad de Drosophila sabor sensilla 4,13,14, la aplicación de este enfoque presenta varios retos técnicos. En primer lugar, el sabor cerdas deben ser identificados en base a la morfología y ubicación espacial. Tras la identificación, las mediciones electrofisiológicas pueden verse limitadas por el pequeño tamaño de la sensilla, con acceso limitado debido a la posición, y la dificultad en la aplicación de volúmenes controlados de un estímulo químico de una muestra de cerdas. Además, la estimulación de sensilla puede generar señales de más de unaneuronal de tipo 15. En segundo lugar, la detección de señales eléctricas puede ser confundida por el ruido de fondo resultante de las vibraciones mecánicas y el ruido de los equipos electrónicos. En tercer lugar, el uso de un electrodo de afilado puede dañar la preparación mosca, si se usa incorrectamente 14. Por último, el montaje de una plataforma de electrofisiología requiere componentes electrónicos especializados para la entrega de estímulos, la grabación de la señal, y el análisis de datos y puede ser costoso.
En D. melanogaster, la disponibilidad de herramientas codificados genéticamente ha facilitado el desarrollo de técnicas de imagen que permiten estudiar las respuestas de pequeñas poblaciones de neuronas. Uno de estos métodos es el uso del reportero Calexa 16. En este método, las secuencias de genes que codifican el factor de transcripción LexA-VP16 y una sensible al calcio NFAT proteínas se fusionan juntos. la activación de calcio de la fosfatasa calcineurina cataliza la fosforilación de de-NFAT y, a su vez, faciTES su importación en el núcleo. Dentro del núcleo, el dominio LexA se une a un motivo de unión LexAop-DNA que dirige la expresión de un reportero de la proteína fluorescente verde (GFP), permitiendo así la identificación sostenida de las neuronas funcionalmente activados. El enfoque ha sido utilizado con éxito para medir la respuesta de los glomérulos olfativo específico en el lóbulo antenal después de la exposición de las moscas en vivo a un odorante 16. Recientemente, las respuestas fisiológicas de los receptores gustativos IR52c neuronas se miden a partir de moscas vivas utilizando Calexa 7. Sin embargo, para este estudio, fue necesario moscas de edad para un máximo de 6 semanas para mejorar la transcripción de GFP. Mientras inmunotinción con un anticuerpo anti-GFP se puede utilizar para aumentar la señal Calexa, este método requeriría la fijación del tejido, impidiendo así la posibilidad de formación de imágenes de células vivas.
El calcio GCaMP proteína indicador codificado genéticamente también se ha utilizado ampliamente para estudiar las respuestas neuronales en un número de17 especies. El GCaMP proteína fluorescente de baja intensidad antes de la estimulación neuronal. La aplicación de un estímulo desencadena un potencial de acción en la neurona, resultando en la afluencia de Ca2 +. GCaMP, unido a Ca 2 +, sufre un cambio conformacional, haciendo que se fluorescencia con una intensidad más brillante (Figura 1). Se utilizó un enfoque de imágenes de calcio de una sola neurona recientemente desarrollado para identificar la glucosa como el ligando para las neuronas gustativas Gr61a específicos pata delantera 18. En este estudio, las patas delanteras disecados de Drosophila transgénica que expresa GCaMP en las neuronas gustativas Gr61a se cubrieron con una capa de agarosa antes de la imagen. Sin embargo, el uso de tejido diseccionado puede causar eventual resumen de expresión GCaMP, limitando así el tiempo de medición y la sensibilidad de detección. Además, puede limitar la sensibilidad de agarosa debido a los altos niveles de fondo de fluorescencia y sus propiedades de dispersión de la luz.
To tratar algunos de estos inconvenientes, se describe el uso de imágenes de calcio mediada por GCaMP para registrar las respuestas fisiológicas de la pata delantera y el trompa neuronas gustativas de los animales intactos. Mostramos las respuestas fisiológicas de Gr68a y neuronas que expresan ppk23 codificado genéticamente GCaMP5G 19 a una feromona de lípidos Drosophila, (3 R, 11 Z, 19 Z) -3-acetoxi-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. Las respuestas neuronales se miden mediante la cuantificación del aumento de la fluorescencia de la señal GCaMP5G durante la estimulación de feromonas. En este protocolo, las neuronas se crean imágenes para una duración total de 120 seg, que es suficiente para diferenciar los patrones de activación neuronal en células individuales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se describe aquí un método para realizar las imágenes en vivo de calcio de las neuronas periféricas de Drosophila en 2 órganos sensoriales diferentes. El Ca2 + -evoked respuestas fluorescentes GCaMP en Gr68a-neuronas inducidos por el ligando feromona CH503 eran dependientes de la dosis y cuantitativa. También era posible discernir diferentes patrones de respuesta neural tales como fásica y respuestas tónicas.
Se cree que las neuronas que muestran respuestas fásic…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).
Materials
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
References
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