हम कवक Aspergillus flavus में एफ्लाटॉक्सिन-संश्लेषण जीन मुंह बंद करने के लिए आरएनए हस्तक्षेप का संकेत होते हैं कि मूंगफली के बीज में aflatoxins और transgene अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए एक विधि का प्रदर्शन। पौधों में mycotoxins के आरएनएआई की मध्यस्थता नियंत्रण पहले से नहीं बताया गया है।
संयुक्त राष्ट्र के खाद्य और कृषि संगठन दुनिया में खाद्य फसलों का 25% aflatoxins साथ दूषित कर रहे हैं कि अनुमान है। यही कारण है कि भोजन के 100 लाख टन से नष्ट कर दिया या प्रत्येक वर्ष गैर मानव उपभोग के लिए भेज दिया जा रहा है प्रतिनिधित्व करता है। Aflatoxins सामान्य रूप से अनाज, नट्स, रूट फसलों और अन्य कृषि उत्पादों में कवक Aspergillus flavus और ए parasiticus द्वारा संचित शक्तिशाली कार्सिनोजन हैं। मूंगफली पौधों में शाही सेना के हस्तक्षेप (आरएनएआई) द्वारा पांच एफ्लाटॉक्सिन-संश्लेषण जीन का मुंह बंद ए के साथ टीका निम्नलिखित एफ्लाटॉक्सिन संचय नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था flavus। ये आम तौर पर एफ्लाटॉक्सिन-अनुकूल परिस्थितियों के तहत कुछ बीज, और बड़े क्षेत्र प्रयोगों के पारंपरिक तरीकों का उत्पादन के रूप में पहले, कोई विधि, व्यक्ति मूंगफली ट्रांसजेनिक घटनाओं में आरएनएआई की प्रभावशीलता का विश्लेषण करने के लिए एक विकल्प नहीं थे अस्तित्व में। क्षेत्र में, स्वाभाविक रूप से दूषित बीज पाने की संभावना, 1/1 करने के लिए अक्सर 1/100 हैइसके अलावा 000, एफ्लाटॉक्सिन संदूषण समान रूप से वितरित नहीं किया गया है। हमारे विधि वास्तविक समय पीसीआर (आरटी पीसीआर) के लिए कार्रवाई की छोटे टुकड़े या छोटे आरएनए अनुक्रमण के साथ, ट्रांसजेनिक घटना के अनुसार कुछ बीज का उपयोग करता है, और अल्ट्रा-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (UPLC) द्वारा एफ्लाटॉक्सिन संचय के विश्लेषण के लिए। आरएनएआई व्यक्त मूंगफली लाइनों 288-72 और 288-74, 14,000 एनजी तक जमा कि नियंत्रण की तुलना में एफ्लाटॉक्सिन बी 1 में 100% की कमी (p≤0.01) और बी 2 के लिए आए थे। जी -1 एफ्लाटॉक्सिन बी 1 जब की aflatoxigenic ए के साथ टीका flavus। संदर्भ के रूप में, संयुक्त राज्य अमेरिका में मानव उपभोग के लिए स्वीकार्य aflatoxins की अधिकतम कुल 20 एनजी है। जी -1। इस प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक मूंगफली बीज और उसके मूल्यांकन के लिए तरीकों में aflatoxins की आरएनएआई की मध्यस्थता नियंत्रण के आवेदन का वर्णन है। हम मूंगफली और अन्य फसलों के प्रजनन में अपने आवेदन विज्ञान के इस महत्वपूर्ण क्षेत्र में तेजी से उन्नति लाएगा का मानना है कि, चिकित्सा और मानव पोषण, और काफी प्रमुख खाद्य फसलों में aflatoxins, और संभवतः अन्य mycotoxins नियंत्रित करने के लिए अंतरराष्ट्रीय प्रयास में योगदान करेगा।
लगभग 4.5 अरब लोगों को लंबे समय से aflatoxins 1, प्रकृति 2 में जाना जाता है सबसे शक्तिशाली carcinogens को उजागर कर रहे हैं। ये mycotoxins मक्का, कसावा, चावल, नट, अनाज और मसाले सहित दुनिया 3, में खाद्य फसलों का 25% दूषित। 4। बच्चों को 5 में stunting कारण aflatoxins, प्रतिरक्षा प्रणाली को 6 ख़राब मानव बायोप्सी 7.8 में हेपैटोसेलुलर-कार्सिनोमा के 58% में मौजूद हैं, और aflatoxicosis 9,10 की आवधिक प्रकोप के दौरान सैकड़ों लोगों को मार डालते हैं। Aflatoxins सामान्य रूप से Aspergillus flavus और ए द्वारा उत्पादित polyketide व्युत्पन्न mycotoxins हैं parasiticus; aflatoxins बी 1 और बी 2 ए द्वारा उत्पादित कर रहे हैं flavus, ए, जबकि parasiticus भी जी 1 और जी 2 पैदा करता है। इन यौगिकों और UPLC से उनकी जुदाई दिखा एक वर्णलेख की रासायनिक संरचना चित्रा 1 में दिखाया जाता है। </strओंग>
चित्रा 1. Aflatoxins और आरएनएआई डालने के शीर्ष पर:। चार सबसे आम polyketide व्युत्पन्न aflatoxins की रासायनिक संरचना (बाएं) और (दाएं) वर्णलेख का उदाहरण: बी 1, बी 2, जी 1 और जी 2, एसपरजिलस parasiticus, ए द्वारा उत्पादित ।। flavus बी 1 और बी 2 नीचे का उत्पादन: आरएनएआई में जीन टुकड़े के योजनाबद्ध तीरों के तहत संख्या Aspergillus flavus जीनोम में जीन-टुकड़ा परिग्रहण संख्या रहे हैं, p5XCAPD मूंगफली परिवर्तन के लिए प्रयोग किया जाता है का निर्माण; PIV2: आलू Intron; बीपी: आधार जोड़े; RT_5X_1 और RT_5X_2:। वास्तविक समय पीसीआर प्राइमर साइटों यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
गणना 4 पर आधारित है, तो कारण मूंगफली में aflatoxins को निर्यात में आर्थिक नुकसान अकेले $ 450,000,000 अमरीकी डॉलर से अधिक एनजी। जी -1 यूरोपीय संघ के 11 में मानव उपभोग के लिए अनुमति एफ्लाटॉक्सिन की सीमा। Aflatoxins 60 वर्ष 12 के लिए जाना जाता रहा है; कई कृषि पद्धतियों अन्य कवक उपभेदों 13,14 के आवेदन सहित उनके प्रभाव को कम करने के लिए विकसित किए गए हालांकि, हालांकि, नियंत्रण की कोई सुसंगत विधि मौजूद है, और प्रतिरोधी संयंत्र किस्मों उपलब्ध नहीं हैं। यहां तक कि रोगज़नक़ आक्रमण के लिए अनुकूल परिस्थितियों में, mycotoxin संचय अप्रत्याशित है और एक सामान्य वितरण का पालन नहीं करता, क्योंकि aflatoxins के प्रतिरोध के लिए परीक्षण संयंत्र जर्मप्लाज्म, विशेष रूप से कठिन है। इस प्रकार, प्रयोगों आमतौर पर बीज और 100-1,700 जी के कई नमूने के सैकड़ों डेटा 15,16 की परिवर्तनशीलता को कम करने, बड़े रोपण क्षेत्रों की आवश्यकता होती है।
शाही सेना के हस्तक्षेप था1998 17 में पता चला; और "मुंह बंद" का लाभ वर्तमान में नए आवेदनों की संख्या, उदा में पता लगाया जा रहा है।, मेटास्टैटिक स्तन कैंसर के 18, यकृत कैंसर के 19, माइलॉयड ल्यूकेमिया 20, और कीड़ों 21 और नेमाटोड 22 लोगों के खिलाफ पौध संरक्षण खिलाफ मानव चिकित्सा में। पौधों में, आरएनए हस्तक्षेप का संकेत भी संयंत्र मेजबान 25 के साथ निकट संपर्क में हैं कि कवक रोगजनकों के अंदर, 23,24 मुंह बंद प्रणालीगत posttranscriptional जीन के लिए जिम्मेदार होने के छोटे दखल शाही सेना (siRNA) और उच्च आणविक भार शाही सेना के साथ, सेल करने के लिए सेल यात्रा कर सकते हैं। फंगल रोगज़नक़ जीनों के संयंत्र की मध्यस्थता मुंह बंद करने पर आरएनएआई की प्रभावशीलता इन के लिए, कुछ संयंत्र pathosystems में वर्णित किया गया है, पौधों (पत्ते) के हवाई भागों में लक्षणों के दृश्य परीक्षा सलाद 26 में रोग मात्रा का ठहराव, यानी, oomycete Bremia अनुमति गेहूं में Puccinia <suकेला 28 में p> 27 और फ्यूजेरियम। उससे भी ज्यादा मुश्किल पत्ते, (बीज) पर हमला किया अंगों मिट्टी के कई इंच के तहत कर रहे संक्रमण का कोई लक्षण दिखाने के रूप में मूंगफली में पौधों में mycotoxins, विशेष रूप से aflatoxins नियंत्रित करने के लिए आरएनएआई प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए है, संक्रमण की घटना अप्रत्याशित है, और केवल रासायनिक है विश्लेषण aflatoxins की उपस्थिति निर्धारित कर सकते हैं। इसके अलावा, मूंगफली में प्रत्येक ट्रांसजेनिक घटना सामान्य रूप से कुछ बीज (संयंत्र प्रति 4-6) पैदा करता है; इसलिए, बड़े क्षेत्र भूखंडों में एक नहीं, एफ्लाटॉक्सिन संचय विशेषता, पूरी फसल सीज़न चलने, और बीज के सैकड़ों प्रयोग करने के लिए परंपरागत परीक्षण संभव नहीं है। एक विधि कम से कम एक सप्ताह में विश्लेषण करने के लिए यहाँ वर्णन किया गया है, केवल कुछ बीज का उपयोग कर transgene की उपस्थिति के लिए और एक नहीं एफ्लाटॉक्सिन संचय विशेषता के लिए आरएनएआई मूंगफली बीज,।
संयंत्र मेजबान पौधों में mycotoxin संचय की आरएनएआई की मध्यस्थता नियंत्रण की व्यवहार्यता दिखा कोई प्रकाशनों देखते हैं, कवक रोगज़नक़ों में जीन का मुंह बंद करने हालांकि, 27,43 प्रदर्शन किया गया है आरएनएआई की मध्यस्थता। पत्तियों भूमिगत फली की फंगल संक्रमण पर कोई लक्षण नहीं दिखाई के रूप में मूंगफली में इन अध्ययनों के लिए एक सीमित कारक, व्यक्तिगत पौधों में एक नहीं, एफ्लाटॉक्सिन संचय फेनोटाइप मूल्यांकन करने के लिए एक विधि का अभाव था। इसके अलावा, aflatoxins की नहीं-सामान्य रूप से वितरित संचय, और रासायनिक विश्लेषण 15,16 के लिए बड़े नमूने के लिए की जरूरत है एक ही पौधे पर संभावित आरएनएआई प्रभाव की मात्रा का ठहराव रुकावट है। यहाँ प्रस्तुत विधि तीन प्रतियों में तीन 24 घंटा अंतराल नमूनों (तालिका 1, चित्रा 7) प्रदर्शन करने के लिए पाँच बीज का उपयोग कर 72 घंटा प्रयोगों के होते हैं। बीज की कोई कम से कम 100 ग्राम की आवश्यकता है कि ठेठ एफ्लाटॉक्सिन विश्लेषण की तुलना में हमारे विधि individua के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैशुरू में दो या तीन फली से अधिक नहीं है जो उत्पादन मूंगफली पौधों के एल ट्रांसजेनिक घटनाओं।
एफ्लाटॉक्सिन संश्लेषण की शाही सेना की मध्यस्थता मुंह बंद आनुवंशिक रूप से Aspergillus flavus और ए बदलने के द्वारा प्रदर्शन किया गया है parasiticus। AflR ए में एफ्लाटॉक्सिन उत्पादन का एक मुख्य नियामक है इसलिये flavus और ए parasiticus 44,45, यह पौधों में शाही सेना की मध्यस्थता मुंह बंद करने के लिए एक दिलचस्प लक्ष्य बन जाता है। हालांकि, aflR में आनुवंशिक विविधताओं Aspergillus प्रजातियों 46 के बीच में दिखाया गया है, और संयंत्र की मेजबानी में उत्पादित आरएनएआई संकेत के साथ मिलान कोई सही अनुक्रम है, अगर वहाँ उन आनुवंशिक वेरिएंट मुंह बंद करने से बच सकता है। इस प्रकार, aflR वेक्टर p5XCAPD में मुंह बंद करने के लिए लक्ष्यों में से एक था, लेकिन केवल एक ही नहीं था। ए में पेश aflR जीन के उल्टे दोहराता flavus और ए परिवर्तन से parasiticus कम या कोई उत्पाद और मुंह बंद करने के परिणामस्वरूपaflatoxins 47 के आयन (मैकडॉनल्ड्स एट अल।, 2005b)। इसके अलावा, मुंह बंद aflD जीन ए में करने के लिए 98% से एफ्लाटॉक्सिन उत्पादन रोका flavus और ए प्रत्यक्ष परिवर्तन 48 में parasiticus। हमारी प्रणाली में सफलता की संभावना बढ़ाने के लिए, मूंगफली ए में एफ्लाटॉक्सिन उत्पादन में शामिल पांच जीनों के उल्टे दोहराने के टुकड़े के साथ तब्दील हो गया था flavus। यहाँ यह एफ्लाटॉक्सिन संश्लेषण मार्ग में कई जीन मुंह बंद करने के लिए है कि लक्ष्य p5XCAPD, 90% एफ्लाटॉक्सिन बी 1 और बी 2 के -100% निचले स्तर का उपयोग कर लाइन 288-72 में प्राप्त किया गया है कि दिखाया गया है, और 60-100% निचले स्तर में जमा है आधा बीजपत्र ए के साथ inoculated थे जब नियंत्रण, की तुलना में लाइन 288-74 flavus, 7 4 आंकड़े। सबसे महत्वपूर्ण बात, इस विधि पैरामीट्रिक आंकड़े को लागू करने से 288-74 नियंत्रण बनाम प्रयोग भर लाइनों 288-72, द्वारा एफ्लाटॉक्सिन संचय में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेदों का पता चलाtics, चित्रा 7। छोटा सा नमूना आकार को देखते हुए, यह इन प्रयोगों के एक उच्च संकल्प, उच्च प्रदर्शन और की तुलना में तीन गुना अधिक संवेदनशीलता से पांच गुना है जो UPLC द्वारा विश्लेषण किया गया aflatoxins पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली तरीका इस्तेमाल करने के लिए आवश्यकता को रेखांकित करने के लिए महत्वपूर्ण है एचपीएलसी 49।
आरएनएआई की अभिव्यक्ति डालने 288-74 में केवल 24 घंटा ऊष्मायन पर अपरिपक्व बीजपत्र (पीला) में पाया गया था। आरएनएआई डालने 24 घंटा में 288-74 के परिपक्व बीजपत्र पर आरटी पीसीआर से पता नहीं था, या 48 घंटा, चित्रा 6 पर किसी भी परिपक्वता समूह पर। यह एक ही घटना अन्य आरएनएआई ट्रांसजेनिक मूंगफली लाइनों में मनाया गया (एरियस, रुपये, 2015 अप्रकाशित), आमतौर पर आरएनएआई टेप केवल 24 घंटा में अपरिपक्व बीजपत्र पर पता चला रहे थे जहां। शाही सेना के नमूने सीडीएनए संश्लेषण से पहले DNase साथ इलाज किया गया, डेटा एक्टिन अभिव्यक्ति के स्तर पर और मनाया गया डीएनए संदूषण का कोई सबूत के लिए सामान्यीकृत थे। डीएनए नमूनों में मौजूद होना चाहिए था, यह चाहिएके रूप में अच्छी तरह से 48 घंटे के नमूने में पाया है, लेकिन लगातार यह मामला नहीं था कर दिया गया है। 35S-प्रमोटर के नियंत्रण के तहत अभिव्यक्ति हमेशा एक समान नहीं है; यह पर्यावरण की स्थिति 50, ऊतक और विकास मंच 51,52 के प्रकार से प्रभावित हो सकते हैं। इसी समय, शाही सेना के हस्तक्षेप के मार्ग में, mRNA के क्षय की दर और siRNA क्षय की दर काफी 53 अलग-अलग हो सकते हैं। यह शाही सेना के हस्तक्षेप के तंत्र द्वारा mRNA का तेजी से क्षरण 48 घंटा ऊष्मायन पर mRNA पता लगाने को रोका जा सकता था कि संभव है। 48 घंटा में अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति कम 35S-प्रमोटर संचालित प्रतिलेखन की वजह से था या नहीं, या पासा खेलनेवाला द्वारा dsRNA की तेज गिरावट के जवाब दिए जाने की बनी हुई है। इस प्रकार, उच्च throughput अनुक्रमण द्वारा छोटे RNAs का पता लगाने के आरएनएआई 54 के माध्यम से जगह लेने की प्रक्रिया पर एक बेहतर जानकारी देंगे इन प्रयोगों में। हालांकि, आरएनए मुंह बंद करने में मुख्य रूप से photosynt से फ्लोएम के माध्यम से, प्रणालीबद्ध फैलता है के बाद से55 (इस मामले मूंगफली के बीज में) डूब sucrose के लिए, एफ्लाटॉक्सिन-संश्लेषण का मुंह बंद करने डालने आरएनएआई की स्थानीय अभिव्यक्ति के बिना बीज में हो सकते हैं स्रोतों से नफरत है। अधिक से अधिक शोध के बीज में एफ्लाटॉक्सिन संचय को रोकने के लिए आवश्यक छोटे दखल RNAs (siRNAs) की दहलीज स्तर निर्धारित करने के लिए किया जाना बना रहता है। यह आरएनएआई की दोनों, mRNA अभिव्यक्ति (चित्रा 6) के निर्माण के तथ्य यह है कि जोर देना जरूरी है, और aflatoxins बी 1 और बी 2 (चित्रा 7) के संचय बनाम अपरिपक्व (पीला) के लिए अलग-अलग परिणाम दिखाया। परिपक्व (ब्राउन) बीजपत्र। मूंगफली पौधों वह यह है कि वे फसल परिपक्वता फली की एक श्रृंखला, चित्रा 2 में मौजूद है, अनिश्चित वृद्धि की है। इसके अलावा, विभिन्न परिपक्वता समूहों से बीज, उनकी रासायनिक संरचना में भिन्न होते हैं जैसे।, 2.4% अपरिपक्व बीज में सुक्रोज, और 1.9% में एक ही क्षेत्र की स्थिति 56,57 के तहत परिपक्व बीज। इस प्रकार, वास्तविक efficienc समझने के लिएएफ्लाटॉक्सिन संचय की शाही सेना की मध्यस्थता नियंत्रण के y, यह अलग से परिपक्वता समूहों का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है।
मूंगफली के बीज के एक प्राकृतिक रक्षा उत्पादन यौगिकों और बीज और पर्यावरण की स्थिति 58-61 की परिपक्वता के आधार पर उनके रिश्तेदार मात्रा की विविधता में बदलता है जो Phytoalexins का उत्पादन होता है, और यह बीजपत्र 62 की तुलना में भ्रूण में विशेष रूप से अधिक है। भ्रूण भी (अप्रकाशित एरियस रुपये,) न्यूक्लिक एसिड, बीजपत्र से दोनों डीएनए और आरएनए की काफी उच्च सांद्रता है। मूंगफली का बीज परिपक्व रूप में, उनके शरीर विज्ञान और रासायनिक संरचना में परिवर्तन 63 होते हैं। Fungistatic गतिविधि 64 के साथ मूंगफली टेस्टा प्रपत्र सघन टैनिन में फिनोलिक एंटीऑक्सीडेंट; टैनिन और phenolic यौगिकों की अपनी सामग्री परिपक्वता 65 के साथ बढ़ जाती है, क्योंकि यह भी 35 काला करने के लिए पीले रंग की परिपक्वता चरणों, दर्शाता है कि Mesocarp रंग में स्पष्ट है। टी के प्रकार, उपस्थितिउनके रोगाणुरोधी संपत्तियों दिया एस्टा या प्रयोग में भ्रूण, कवक विकास सीमित है और इसलिए इसलिए, वे हटा दिया गया है, आरएनएआई मुंह बंद करने के प्रभाव को जरुरत से ज्यादा हो सकता था। इसके अलावा, टेस्टा और भ्रूण को हटाने के भ्रूण अधिक Phytoalexins और अधिक आरएनए सामग्री होगा किया जाता है कि आधे अंकुर के रूप में, विश्लेषण में अंतर के स्रोतों की सीमा में मदद करता है।
परिपक्वता समूहों और इन प्रयोगों में टेस्टा और भ्रूण को हटाने के द्वारा विश्लेषण करने के लिए इसके अलावा, यह कुछ और टिप्पणियों बाहर बात करने के लिए महत्वपूर्ण है: एक) का परिणाम है अप करने के लिए 96 घंटे ऊष्मायन के लिए दिखाए गए हैं, हालांकि यह कोई 72 से अधिक उपयोग करने के लिए सिफारिश की है बीज 96 घंटा के द्वारा अपमानित पाने के रूप में मानव संसाधन, अनुरूप परिणाम प्राप्त करने के लिए; और ख) एक ही बीज से आधा बीजपत्र, यादृच्छिक पर नमूना है, हालांकि पूरी तरह से स्वतंत्र नमूने का गठन नहीं है, जबकि आरटी पीसीआर और ट्रांसजेनिक घटनाओं के भीतर एफ्लाटॉक्सिन संचय बीज के बीच न्यूनतम भिन्नता देखी गई। इसके अलावा, एक सटीक कवक बीजाणु, inoculum मात्रा गिनती2 μl की है, और किनारों पर टपकता परहेज बीजपत्र की कटौती की सतह पर बीजाणुओं के आवेदन अंकुरित बीजाणुओं संयंत्र के ऊतकों को उजागर कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। प्लेटों पर पानी / अगर चित्रा 4 (नीचे) की अंतिम सीमा पर दिखाया (v / डब्ल्यू), नरम अगर बीजाणुओं का अपवाह का कारण बनता है 1.5% से कम होना चाहिए। ; एक विशेष ट्रांसजेनिक घटना से सीमित हो उपलब्धता बीज चाहिए, नमूने के बजाय तीन प्रतियों प्राप्त करने के इसी तरह के परिणाम की (यानी, चित्रा 7) दो प्रतियों में किया जा सकता है हालांकि, तीन प्रतियों के नमूने मानक त्रुटि को कम करने में मदद मिलेगी। इस पद्धति का ही सीमा है कि यह एफ्लाटॉक्सिन का पता लगाने / मात्रा का ठहराव के लिए एक बेहद संवेदनशील प्रणाली (UPLC) की आवश्यकता है, लेकिन एक ही समय में यह कम संवेदनशील तरीकों से aflatoxins नहीं पाया जा चाहिए आरएनएआई के प्रभाव overestimating की संभावना कम कर देता है।
अंत में, इस विधि से पहली बार के लिए अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय दृष्टिकोण प्रदान करता हैaflatoxins के नियंत्रण में आरएनएआई का असर। कम से कम एक सप्ताह के लिए एक पूरी फसल मौसम से एक प्रयोग के लिए समय को कम करने, इस विधि काफी शमन और / या aflatoxins के उन्मूलन की दिशा में आरएनएआई मूंगफली / एसपरजिलस pathosystem पर अनुसंधान को गति देगा।
The authors have nothing to disclose.
This work received the financial support of USDA-ARS CRIS project 6604-21000-004-00D, CRIS project 6604-42000-008-00D, and USAID Feed-the-Future program Agreement number 58-0210-3-012. We thank Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell and Kathy Gray for their technical assistance. Mention of trade names or commercial products in this article is solely for the purpose of providing specific information and does not imply recommendation or endorsement by the US Department of Agriculture.
Primers, oligonucleotides | DNA Technologies, Coralville, IA, USA | n/a | |
Dneasy Plant Mini Kit | Qiagen, Valencia, CA | 69106 | |
Czapek Dox agar medium | Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | CM0095 | |
Agar | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | BP 1423 | |
Freezer -80°C | n/a | n/a | |
Aluminum Oxide, Al2O3 | Fisher Scientific | A941 | |
SPE Reservoirs 1.5 mL | Grace Davison Discovery Scientific | 210011 | |
Frits for 1.5 mL SPE reservoir | Grace Davison Discovery Scientific | 211401 | |
Autosampler vials | Waters Corporation, Milford, MA | 186005221 | |
Waters Acquity Ultra-Performance Liquid-Chromatography (UPLC) instrument; UPLC-H-Class Quaternary Solvent Manager; UPLC Sample Manager; UPLC Fluorescent detector (FLR); UPLC BEH C18 2.1mmx50mm, 1.7mm column | Waters Corporation, Milford, MA | ||
Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer, with Xcalibur version 1.4 software | Thermo Electron Corp., San Jose, CA | ||
Aflatoxin standards, B1, B2, G1 and G2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A6636; A9887; A0138; A0263 | |
Systat Software 12.2 | SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA | ||
Trizol reagent | Invitrogen, CA | 15596-018 | |
SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix | Invitrogen, CA | 11752-050 | |
ABI 7500 Real-Time PCR | Lifetechnologies, Grand Island, NY | 4406984 | |
Luria Broth-Miller | Fisher Scientific | R453642 | |
pENTR1A | Invitrogen, CA | A10462 | |
LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-020 | |
T4 DNA Ligase | NEB Biolabs | M0202L | |
Gelrite | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1919 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D134406 | |
QIAcube robot workstation | Qiagen, Valencia, CA | 9001292 | |
Antibiotics: kanamycin, cefotaxime, gentamicin; streptomycin | Goldbio, St. Louis, MO | cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50 | |
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, CA | 11304-029 |