Les mécanismes moléculaires de la décondensation de la chromatine mitotique hautement compactée sont mal définis. Nous présentons un test acellulaire basé sur des amas de chromatine mitotique isolés de cellules HeLa et d’extrait d’œuf de Xenopus laevis qui reconstitue fidèlement le processus de décondensation in vitro.
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Article de méthode
A Cell Assay libre d'étudier décondensation de chromatine à la fin de la mitose
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Au cours du cycle cellulaire des vertébrés, la chromatine subit d’importants changements structurels et fonctionnels. Lors de l’entrée mitotique, il se condense massivement en chromosomes en forme de bâtonnet qui sont déplacés individuellement par l’appareil du fuseau mitotique. La condensation mitotique de la chromatine donne des chromosomes compactés cinquante fois plus denses qu’en interphase. Lors de la sortie de la mitose, les chromosomes doivent rétablir leur état d’interphase fonctionnel, qui est entouré d’une enveloppe nucléaire et est compétent pour la réplication et la transcription. Le processus de décondensation est bien décrit morphologiquement, mais en termes moléculaires mal compris : nous manquons de connaissances sur les événements moléculaires sous-jacents et, dans une large mesure, sur les facteurs impliqués ainsi que sur leur régulation. Nous décrivons ici un système acellulaire qui récapitule fidèlement la décondensation de la chromatine in vitro, basé sur des amas de chromatine mitotiques purifiés à partir de cellules HeLa synchronisées et d’extrait d’œuf de X. laevis. Notre système acellulaire fournit un outil important pour la caractérisation moléculaire plus poussée de la décondensation de la chromatine et sa coordination avec les processus se produisant simultanément lors de la sortie mitotique, tels que le réassemblage de l’enveloppe nucléaire et du complexe de pores.
Introduction
Xenopus laevis extrait d'oeuf est un outil puissant et largement appliquée pour étudier les événements cellulaires complexes dans la simplicité d'un essai acellulaire. Depuis leur première description par une Lohka & Masui ils ont été largement utilisés pour étudier les processus mitotiques telles que la condensation de la chromatine 2, l'assemblage de broche 3, l'enveloppe nucléaire ventilation 4, mais également transport nucléocytoplasmique 5 ou 6 replication de l'ADN. Les événements qui se déroulent à la fin de la mitose, nécessaires pour la réforme du noyau interphasiqu....
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Protocole
Cluster mitotique chromatine isolement de cellules HeLa
1. Préparatifs
- Solutions de culture cellulaire
- Préparation du milieu de Eagle modifié par Dulbecco complet (DMEM) en ajoutant 10% de sérum de veau foetal, 100 unités / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine et 2 mM de glutamine à la DMEM. Préparer une solution saline de tampon phosphate (PBS) contenant 2,7 mM de KCl, 137 mM de NaCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2H 2 O et 2 mM de KH 2 PO 4 dans de l'eau désionisée, et ajuster le pH à 7,4 avec NaOH 10 N.
REMARQUE: PBS peu....
- Préparation du milieu de Eagle modifié par Dulbecco complet (DMEM) en ajoutant 10% de sérum de veau foetal, 100 unités / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine et 2 mM de glutamine à la DMEM. Préparer une solution saline de tampon phosphate (PBS) contenant 2,7 mM de KCl, 137 mM de NaCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2H 2 O et 2 mM de KH 2 PO 4 dans de l'eau désionisée, et ajuster le pH à 7,4 avec NaOH 10 N.
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Résultats
La dépendance du temps de la réaction de décondensation
La figure 1 montre une évolution dans le temps typique de l'analyse de décondensation. Le groupe de chromosomes visibles au début de la réaction decondenses et fusionne en un seul, ronde et lisse noyau. Quand l'extrait d'œuf est remplacé par un tampon saccharose de la grappe reste chromosome condensé, ce qui suggère que l'activité de décondensation est présente dans l'extrait d'œuf.
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Discussion
Xenopus laevis extraits d'œufs sont un outil très utile pour reproduire fidèlement les processus cellulaires in vitro, et ce système a été utilisé avec succès dans la caractérisation des événements du cycle cellulaire et la division cellulaire 2, 3,5,6,17. En raison de grands magasins de composants nucléaires séquestrés dans l'œuf cours de l'ovogenèse, extraits d'œufs sont une excellente source de composants cellulaires. Comparé à d'autres approches comme ARNi .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande pour la recherche et l'ERC (AN377 / 3-2 et 309528 CHROMDECON à WA) et d'un doctorat de la Bourse Boehringer Ingelheim Fonds AKS Figure 1 & 2 sont reproduites à partir de Developmental Cell 31 (3), Magalska et, la fonction des ATPases RuvB-comme dans décondensation de chromatine à la fin de la mitose, 305-318 2014 al., avec l'aimable autorisation de Elsevier.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| tétrachlorhydrate de spermine | Fluka analytique | 85610-25G | |
| trichlorhydrate de spermidine | Sigma ; | S2501-5G | |
| digitonine de haute pureté | Millipore | 300410-1GM | toxique |
| PMSF | Applichem | A0999,0100 | |
| thymidine | Calbiochem | 6060 | |
| nocodazole | Calbiochem | 487928 | toxique |
| 37 % formaldéhyde solution | Roth | 7398-1 | toxik |
| trypan blue solution (0,4 % ) | Sigma | T8154 | |
| toxique 1,4-dithiothréitol (DTT) | Roth | 6908.2 | |
| Chlorhydrate AEBSF | Applichem | A1421,0001 | |
| pepstatine | Roth | 2936.1/2/3 | |
| leupeptine | Roth | CN334 | |
| aprotinine | Roth | A162.3 | |
| Percoll (particules de silice colloïdale solution) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Pénicilline-streptomycine | Gibco | 15140-122 | |
| 75 cm² ; flacons de culture tissulaire | Greiner Bio-one | 658175 | |
| sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
| Homogénéisateur (broyeur de tissus de 40 ml) | Wheaton | 357546 | |
| chambre Neubauer | Assistent | 441/1 | |
| ; Oak Ridge Tubes à centrifuger, polycarbonate (50 ml) | Nalgene | 3118-0050 | |
| 100 µ ; Filtre à cellules m, nylon | BD Falcon | 352360 | |
| cytochalasine B | Applichem | A7657,0010 | |
| cycloheximide | Roth | 8682.3 | |
| L-cystéine | Merck | 1,028,381,000 | |
| hCG disponible sous forme Ovogest | MSD | 1431593 | |
| PMSG disponible sous forme Intergonan | MSD | 1431015 | |
| A23187 (mélange calcium-magnésium-sel) | Aiguilles | de | ALX-450-002-M010 |
| (1,20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2") | Braun | 4665120 | |
| ATP | Serva | 10920.03 | |
| GTP, 2 Na x 3 H20 | Roth | K056.1/2/3/4 | |
| créatine phosphat sel disodique | Calbiochem | 2380 | |
| créatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| DMAP | Sigma | D2629-1G | |
| DAPI ; | Roche | 10236276001 | |
| toxiques | PFA | Sigma | P-6148 |
| pour TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 po) | Beckman Coulter | 343775 | |
| "Cell-Saver » (pointes à large ouverture, 1 000 & micro ; l) | Biozym | 729065 | |
| solution de glutaraldéhyde à 50 %, grade I | Sigma alderich | G7651-10 ml | |
| toxique à 0,1 % (p/v) solution de poly-L-lysine | Sigma | P8920-100 ml | |
| tubes à fond plat (6 ml, 16,0/55 mm) | Greiner Bio-one | 145211 | |
| Vectashield support de montage | Vector laboratories | H1000 | |
| tubes pour TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 po) | Beckman Coulter | 343778 | |
| "Cell-Saver » (pointes à large ouverture, 200 & micro ; l) | Biozym | 729055 | |
| lamelles de protection 12 mm | Thermo Scientific | 0784 #1 |
Références
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
- de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg ext....
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Réimpressions et autorisations
