Porphyromonas gingivalis come organismo modello per la Valutazione Interazione di batteri anaerobici con cellule ospiti

Summary

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Abstract

I batteri anaerobici lontano superano aerobi in molte nicchie umani, come l'intestino, bocca e vagina. Inoltre, infezioni anaerobiche sono comuni e spesso di origine indigena. La capacità di alcuni agenti patogeni anaerobici di invadere le cellule umane dà loro misure di adattamento per sfuggire immunità innata nonché per modulare il comportamento della cellula ospite. Tuttavia, garantire che i batteri anaerobici sono vivo durante un'indagine sperimentale degli eventi che può porre problemi. Porphyromonas gingivalis, un anaerobio Gram-negativi, è in grado di invadere una varietà di cellule non fagocitiche eucariotiche. In questo articolo viene descritto come con successo la cultura e valutare la capacità di P. gingivalis di invadere le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). Sono stati sviluppati due protocolli: uno per misurare batteri che possono con successo invadere e sopravvivere all'interno dell'ospite, e l'altro per visualizzare i batteri interagiscono con le cellule ospiti. Queste tecniche richiedono l'uso di un anaeRobic camera per la fornitura di P. gingivalis con un ambiente anaerobico per la crescita ottimale.

Il primo protocollo si basa sulla misurazione di protezione antibiotico, che è ampiamente utilizzato per studiare l'invasione delle cellule ospiti da batteri. Tuttavia, il saggio di protezione antibiotico è limitata; solo i batteri intracellulari che sono coltivabili a seguito di trattamento antibiotico e lisi della cellula ospite sono misurati. Per valutare tutti i batteri interagiscono con le cellule ospiti, sia vivi e morti, abbiamo sviluppato un protocollo che utilizza il microscopio a fluorescenza per esaminare l'interazione ospite-patogeno. I batteri sono fluorescente con 2 ', 7'-Bis- (2-carbossietil) -5- (e-6) -carboxyfluorescein acetossimetil estere (BCECF-AM) e utilizzato per infettare cellule eucariotiche in condizioni anaerobiche. Dopo fissazione con paraformaldeide e permeabilizzazione con 0,2% Triton X-100, cellule ospiti sono etichettati con TRITC falloidina e DAPI etichettare citoscheletro cellulare e nucleo, rispettivamente. Molteplici images prelevati in differenti punti focali (Z-stack) sono ottenuti per la visualizzazione spazio-temporale dei batteri. I metodi utilizzati in questo studio possono essere applicati a qualsiasi anaerobio coltivabili e qualsiasi tipo di cellula eucariotica.

Introduction

Batteri anaerobici colonizzano quasi tutte le superfici del corpo umano. Sebbene predominante nella flora dei tratti intestinali e genito-urinario in cui le concentrazioni di ossigeno sono bassi, esistono anche ad alti livelli sulla pelle, bocca, naso e gola ^1. I batteri anaerobici sono una causa comune di infezioni endogene e sono spesso isolati da siti malati. Tuttavia, a causa della loro natura esigente, anaerobi possono essere difficili da isolare e cultura. Gli studi che coinvolgono batteri anaerobi devono essere effettuate in condizioni ristrette. Tecniche anaerobico-cultura moderna permettono ai ricercatori di imitare le impostazioni anaerobici necessarie per studiare molti ceppi di laboratorio anaerobica o addirittura isolati clinici ^2,3.

Batteri anaerobi patogeni hanno sviluppato un rapporto dinamico e co-evoluzione con le cellule ospiti in cui risiedono. La maggior parte degli anaerobi sono suscettibili di aver ucciso dalla risposta immunitaria dell'ospite prima di raggiungere infectii livelli di unità organizzative. Tuttavia, alcuni batteri patogeni hanno sviluppato meccanismi per sfuggire o sovvertire la risposta immunitaria dell'ospite. Compiono questo obiettivo attraverso meccanismi quali l'evasione del riconoscimento immunitario, la neutralizzazione dei mediatori immunitari, alterazione di immunità cellulo-mediata, l'invasione delle cellule ospiti e l'alterazione delle immunitario segnalazione ^4. Porphyromonas gingivalis, un anaerobio gram-negativi implicati sia orale e malattie extraorali, è un esempio di un batterio patogeno altamente adattato in grado di provocare cambiamenti patogeni nell'ospite ^5-7.

Sacche di biofilm placca accantonati in profonde fessure formatesi tra i denti e tessuto mucoso gengivale può ospitare batteri anaerobici che sono protetti dall'ossigeno atmosferico ^8. Queste tasche parodontali servono come una nicchia per vari patogeni anaerobici, come P. gingivalis ^9. P. gingivalis è un patogeno chiave di volta che è in grado di rimodellareing comunità microbica orale in modo da promuovere lo sviluppo e la progressione delle malattie parodontali ^10. Produce un gran numero di fattori di virulenza che sono attivi contro un ampio spettro di proteine ​​dell'ospite e fornisce meccanismi per evasione di difese dell'ospite ^11. È anche in grado di invadere epiteliali, endoteliali, fibroblasti e cellule del legamento parodontale in vitro e in vivo ^{12-14 15.} Con efficacemente invadere cellule ospiti, P. gingivalis può sfuggire immunità dell'ospite. Invasione efficace delle cellule ospiti non solo permette al batterio di sfuggire difese dell'ospite ma serve anche da serbatoio per il futuro reinfezione e altera la cellula ospite. Sono necessari studi sui meccanismi molecolari coinvolti nella adesione e internalizzazione del batterio da cellule ospiti. La ricerca in diversi laboratori è focalizzata sulla comprensione degli eventi molecolari associati con l'internalizzazione di P. gingivalis da parte delle cellule ospitinonché i meccanismi utilizzati per sopprimere e dirottare la risposta immunitaria e sopravvivere i meccanismi di difesa dell'ospite ostili.

Ci sono molti saggi in grado di identificare e caratterizzare agenti patogeni che sono in grado di invadere cellule ospiti. Tuttavia, studi de vitro con patogeni anaerobici presentano molti problemi sperimentali per il ricercatore principalmente perché è difficile da eseguire studi che si basano su strumenti ingombranti in assenza di ossigeno. La situazione è aggravata dal fatto che le cellule eucariotiche hanno bisogno di ossigeno per crescere e quindi devono essere preparati separatamente in incubatori di coltura dei tessuti. Un modo per evitare tali ostacoli sarebbe quella di effettuare gli studi sotto ossigeno atmosferico, ma che avrebbe fatto la crescita di batteri anaerobi impossibile. Un altro metodo sarebbe quello di utilizzare i batteri ucciso al calore di infettare e studiare le interazioni ospite-cellulari. Tuttavia, esistono delle differenze tra batteri ucciso al calore e vitali che diminuiscono la pertinenza della dello s ospite-patogenosu ^16. E 'centrale per studiare batteri vitali con l'espressione inalterata l'interazione con le cellule ospiti; quindi, i metodi per la coltura di P. gingivalis in un ambiente anaerobico sono dati. Inoltre, sono dimostrati due protocolli convenienti semplici per valutare la capacità di P. gingivalis da interiorizzato da vena cellule umane endoteliali (ombelicali HUVECs). Il primo protocollo si basa sul popolare protection assay antibiotico. Anche se il test è semplice, le considerazioni quando si utilizza microrganismi anaerobi sono dati. Il secondo protocollo richiede l'uso di un microscopio a scansione a fluorescenza per visualizzare interagire e internalizzata P. gingivalis. Ogni test ha i suoi limiti e vantaggi che verranno discusse a rilasciare al ricercatore uno schema per studiare l'invasività dei batteri anaerobici. Anche se il manoscritto corrente studia P. gingivalis e HUVEC, questi protocolli possono essere usati per molti altri batteri anaerobici ecome per altri tipi di cellule ospiti.

Protocol

I seguenti protocolli descrivono i metodi per la coltura e lo studio l'invasione da parte della specie anaerobiche, P. gingivalis; Tuttavia, possono essere utilizzati tali protocolli per un certo numero di agenti patogeni anaerobici. Anche se vengono utilizzati HUVECs, questo protocollo può essere utilizzato per altre cellule eucariotiche sia immunitarie e non immuni. 1. anaerobica Camera uso e manutenzione Nota: P. gingivalis è un anaerobio…

Representative Results

Protocolli di cui sopra sono stati utilizzati nello studio interazione ospite-patogeno tra P. gingivalis e cellule endoteliali. P. gingivalis W83 e un P. gingivalis V3150 portando una delezione di PG0228 stati utilizzati nello studio. Il PG0228 è previsto per codificare una proteina che può alterare i livelli di RNA e proteine, che possono incidere in definitiva interazione di P. gingivalis con cellule ospiti. Per studiare l'effetto di PG0228 su P. capacità di interagi…

Discussion

Tutti i metodi di cui sopra possono essere utilizzati per progettare saggi specifici per valutare l'interazione di batteri anaerobici con cellule eucariotiche. Tuttavia, ci sono diverse considerazioni per eseguire con successo gli esperimenti. Innanzitutto sono i ceppi microbici essere utilizzati in uno studio.

E 'fondamentale nel confronto di due ceppi sia con il saggio di sopravvivenza come anche per microscopia che sono in fase di crescita simili e raggiungono concentrazioni cellu…

Materials

Vinyl Anaerobic Chamber-Type B	Coy Laboratory Products		Model 2000 incubator
TSA II Trypticase Soy Agar w/5% Sheep Blood	BBL	221261
Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool	LifeLine Technology	FC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Technology	LL-0003
TrypKit	LifeLine	LL-0013
Saponin	Riedel-de Haen	16109
Gentamicin Sulfate Salt	Sigma-Aldrich	G-1264
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M-3761
BCECF-AM	LifeTechnologies	B1150
TRITC Phalloidin	Sigma-Aldrich	P1951
18 mm Circular Coverslips	Electron Microscopy Sciences	72222-01
VectaShield Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200