तेल emulsions में पानी: जल विरोधी पिगमेंट के साथ पानी में घुलनशील क्लोरोफिल बाध्यकारी प्रोटीन के संयोजन के लिए एक नई प्रणाली
Summary
यह पांडुलिपि हाइड्रोफोबिक पिगमेंट है कि पानी में तेल emulsions पर आधारित है के साथ पानी में घुलनशील प्रोटीन के संयोजन के लिए एक सरल और उच्च throughput विधि का वर्णन है। हम पुनः संयोजक पानी में घुलनशील-क्लोरोफिल के चार वेरिएंट बाध्यकारी प्रोटीन (WSCPs) की ब्रेसिका पौधों ई में व्यक्त के साथ देशी Chlorophylls की विधानसभा में विधि के प्रभाव को प्रदर्शित कोलाई।
Abstract
Chlorophylls (Chls) और bacteriochlorophylls (BChls) प्राथमिक सहकारकों कि संश्लेषक प्रकाश कटाई और इलेक्ट्रॉन परिवहन के लिए बाहर ले रहे हैं। उनकी कार्यक्षमता गंभीर रूप से बड़े और विस्तृत multisubunit transmembrane प्रोटीन परिसरों के भीतर अपने विशिष्ट संगठन पर निर्भर करता है। आदेश आणविक स्तर कैसे इन परिसरों सौर ऊर्जा रूपांतरण की सुविधा में समझने के लिए, इसे समझने के लिए प्रोटीन-वर्णक, और वर्णक वर्णक बातचीत, और उत्साहित गतिशीलता पर उनके प्रभाव के लिए आवश्यक है। इस तरह समझ पाने का एक तरीका यह निर्माण और सरल पानी में घुलनशील पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ Chls के परिसरों का अध्ययन कर रहा है। हालांकि, पानी में घुलनशील प्रोटीन में lipophilic Chls और BChls को शामिल मुश्किल है। इसके अलावा, वहाँ कोई सामान्य विधि है, जो हाइड्रोफोबिक पिगमेंट के साथ पानी में घुलनशील प्रोटीन की विधानसभा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ, हम एक सरल और उच्च throughput पानी में तेल emulsions पर आधारित प्रणाली है, जो गधा सक्षम बनाता का प्रदर्शनहाइड्रोफोबिक Chls के साथ पानी में घुलनशील प्रोटीन की विधानसभा। नई विधि Chl एक साथ पानी में घुलनशील क्लोरोफिल Brassicaceae पौधों (WSCP) के बंधन प्रोटीन की पुनः संयोजक संस्करणों कोडांतरण द्वारा मान्य किया गया था। हम Chl के सफल विधानसभा ई व्यक्त WSCP की एक का उपयोग कर कच्चे lysates का प्रदर्शन कोलाई सेल, जो Chl प्रोटीन बातचीत और विधानसभा प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए उपन्यास पानी में घुलनशील Chl बाध्यकारी प्रोटीन के लिए एक आनुवंशिक स्क्रीन प्रणाली के विकास के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और।
Introduction
ऐसे chlorophylls (Chls), bacteriochlorophylls (BChls) और carotenoids के रूप में हाइड्रोफोबिक पिगमेंट संश्लेषक प्रतिक्रिया केन्द्रों और प्रकाश कटाई प्रोटीन है कि इलेक्ट्रॉन परिवहन, ऊर्जा और प्रकाश को पकड़ने और हस्तांतरण बाहर ले जाने में प्राथमिक सहकारकों हैं। प्रतिक्रिया केन्द्रों और Chl बाध्यकारी प्रकाश कटाई परिसरों का सबसे transmembrane प्रोटीन होते हैं। गैर oxygenic संश्लेषक हरे-सल्फर जीवाणु 1,2 के Fenna-मैथ्यू ओल्सन (FMO) प्रोटीन, और dinoflagellates 3 की peridinin-Chl प्रोटीन (पीसीपी) पानी में घुलनशील प्रकाश कटाई प्रोटीन की असाधारण उदाहरण हैं। पानी में घुलनशील क्लोरोफिल बाध्यकारी प्रोटीन (WSCPs) Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae की और Amaranthaceae पौधों 4, 5 एक और अनूठा उदाहरण हैं, फिर भी FMO और पीसीपी के विपरीत, ये न तो प्रकाश कटाई में है और न ही प्राथमिक संश्लेषक प्रतिक्रिया में से किसी में शामिल कर रहे हैं और उनके सटीक बनावटsiological कार्यों अभी तक स्पष्ट नहीं 5-8 कर रहे हैं। उनकी उच्च Chl-बंधन आत्मीयता Chls के क्षणिक वाहक और Chl डेरिवेटिव 9,10 के रूप में एक सुझाव समारोह के लिए मार्ग प्रशस्त किया है। वैकल्पिक रूप से, यह धारणा थी WSCP क्षतिग्रस्त कोशिकाओं में Chls सफाई में एक भूमिका निभाता है और Chl प्रेरित photooxidative नुकसान 7,11-13 खिलाफ की रक्षा करता है। अभी हाल ही में यह सुझाव एक protease अवरोध के रूप में उस WSCP कार्यों और शाकाहारी प्रतिरोध के दौरान एक भूमिका निभाता है के रूप में अच्छी तरह से फूल विकास 14 के दौरान कोशिका मृत्यु को नियंत्रित करता था। WSCPs उनकी photophysical गुणों के अनुसार दो मुख्य वर्गों में बांटा जाता है। प्रथम वर्ग (कक्षा मैं, उदाहरण के लिए। बथुआ से) रोशनी पर photoconversion गुजरना सकता है। कक्षा ब्रेसिका पौधों, कि photoconversion 5,10 से गुजरना नहीं है से द्वितीय WSCPs, आगे वर्ग IIa में (उप-विभाजित किया जाता है (उदाहरण के लिए।, ब्रेसिका गोभी, Raphanus सैटाईवस से) और IIb जैसे।, Lepidium virginicum से </eएम>)। Lepidium virginicum से वर्ग IIb WSCP की संरचना 2.0 एक संकल्प 8 पर एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी द्वारा हल किया गया था। यह एक सममित homotetramer जिसमें प्रोटीन एक हाइड्रोफोबिक कोर के रूप में पता चलता है। प्रत्येक सबयूनिट बांधता एक भी Chl जो core.This साधारण सभी Chl व्यवस्था बाध्यकारी और Chl प्रोटीन परिसरों की विधानसभा के अध्ययन के लिए WSCPs बनाता है एक संभावित रूप से उपयोगी मॉडल प्रणाली के भीतर चार पैक निकट Chls की एक तंग व्यवस्था में यह परिणाम है, और पड़ोसी Chls का प्रभाव और व्यक्तिगत Chls के वर्णक्रम और इलेक्ट्रॉनिक गुणों पर प्रोटीन वातावरण। इसके अलावा, यह कृत्रिम Chl बाध्यकारी प्रोटीन है कि कृत्रिम संश्लेषक उपकरणों में प्रकाश कटाई मॉड्यूल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के निर्माण के लिए टेम्पलेट्स प्रदान कर सकता है।
क्योंकि परिसरों पौधों से शुद्ध हमेशा Chl एक के विभिन्न संयोजनों के साथ tetramers की एक विषम मिश्रण होते हैं मूल निवासी WSCPs के कठोर पढ़ाई के संभव नहीं हैंऔर Chl ख 9। इस प्रकार, इन विट्रो में Chls साथ recombinantly व्यक्त WSCPs संयोजन के लिए एक विधि के लिए आवश्यक है। इस Chls की नगण्य पानी घुलनशीलता जो यह बस जलीय समाधान में पिगमेंट के साथ पानी में घुलनशील apoproteins मिश्रण से इन विट्रो में जटिल इकट्ठा करने के लिए असंभव बना देता है द्वारा thylakoid झिल्ली के साथ apoproteins 15 प्रदर्शन किया गया मिश्रण से चुनौती दी है। इन विट्रो विधानसभा, लेकिन इस विधि thylakoids में देशी Chls वर्तमान तक सीमित है। श्मिट एट अल। recombinantly ई में एक हिस्टडीन टैग प्रोटीन व्यक्त करने से फूलगोभी (CaWSCP) से WSCP के साथ कई Chl और BChl डेरिवेटिव कोडांतरण पर रिपोर्ट कोलाई एक नी आत्मीयता स्तंभ पर यह immobilizing और डिटर्जेंट 11 में solubilized Chl डेरिवेटिव शुरू। सफलतापूर्वक ए से पुनः संयोजक WSCPs के पुनर्गठन थालिअना 6, और ब्रसेल्स स्प्राउट्स (BoWSCP), जापानी जंगली मूली (RshWSCP) एकडी वर्जीनिया pepperweed (LvWSCP) एक समान विधि द्वारा भी सूचित किया गया।
यहाँ, हम एक उपन्यास, WSCP साथ Chls कि टैगिंग की आवश्यकता नहीं है कोडांतरण या प्रोटीन immobilizing के लिए सामान्य, सरल तरीका मौजूद है। यह खनिज तेल में पानी में घुलनशील apoproteins के अपने जलीय समाधान से इमल्शन की तैयारी पर निर्भर करता है। प्रोटीन की मात्रा इस प्रकार अनुपात 16 के लिए पानी में तेल (डब्ल्यू / ओ) बहुत उच्च सतह के साथ microdroplets में समझाया जाता है। हाइड्रोफोबिक सहकारकों फिर तेल में भंग कर रहे हैं और आसानी से तेल चरण से बूंदों में पेश कर रहे हैं। हम WSCP apoproteins के कई वेरिएंट recombinantly ई में व्यक्त की संयोजन के लिए विधि का उपयोग पर रिपोर्ट Chl एक साथ कोलाई। हम WSCP-overexpressing जीवाणु जो उपन्यास Chl बंधनकारी प्रोटीन के विकास के लिए एक स्क्रीनिंग प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के कच्चे lysate से विधानसभा प्रदर्शित करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारा लक्ष्य हाइड्रोफोबिक पिगमेंट के साथ पानी में घुलनशील क्लोरोफिल बाध्यकारी प्रोटीन की विधानसभा के लिए एक नया सामान्य प्रणाली विकसित करने के लिए किया गया था। यहाँ यह दिखाया गया है कि नए पुनर्गठन ड?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
डी.एन. यूरोपीय संघ FP7 परियोजनाओं PEPDIODE (जीए 256,672) और REGPOT-2012-2013-1 (जीए 316,157), और एक निजी शोध अनुदान (सं 268/10) इसराइल विज्ञान फाउंडेशन से समर्थन मानता है। हम confocal माइक्रोस्कोपी छवियों को लेने के लिए प्रो Shmuel Rubinstein, स्कूल ऑफ इंजीनियरिंग एंड एप्लाइड साइंसेज, हार्वर्ड विश्वविद्यालय, कैंब्रिज एमए, संयुक्त राज्य अमरीका धन्यवाद।
Materials
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges | Bio Rad | 10011164 | Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence. |
| His Trap HF column | GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag |
| DEAE Sepharose Fast Flow | GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | Chromatography medium for chlorophyll purification |
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