בידוד פיזי של Endospores מדגימות סביבתיות על ידי תמוגה ממוקדת של תאים גטטיבי
Summary
A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.
Abstract
Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.
Introduction
המטרה של עבודה זו היא לספק פרוטוקול להפרדת endospores חיידקים מתאי חיידקים וגטטיבי בדגימות סביבתיות. ההיווצרות של endospores חיידקים היא אסטרטגיית הישרדות, בדרך כלל מופעל על ידי רעב, שנמצאה במספר קבוצות חיידקים המשתייכות למשפחה החסרה 1 Firmicutes. חיידקי יוצרי Endospore נלמדים היטב, בעיקר בגלל מספר זני פתוגנים ומכאן חשיבות רפואית (למשל, anthracis Bacillus או קלוסטרידיום). זני סביבה של חיידקי יוצרי endospore היו מבודדים מכמעט כל סביבה (קרקע, מים, משקעים, בטן חיות אוויר, קרח, מעיים אנושיים, ועוד) 1-3. לכן, Firmicutes הוא המערכה הזאת השנייה בשכיחותו באוספי תרבות 4.
בגלל חלבוני הקליפה חיצונית וליבת מגן הקשוח שלהם, endospores יכול לשרוד בתנאי הסביבה קיצוני החל frהתייבשות אום לקרינה גבוהה, טמפרטורות קיצוניות וכימיקלים מזיקים 5. התנגדות יוצאת דופן זה עושה את זה אתגר לחלץ DNA מendospores 6-8. זה סביר מסביר מדוע הם התעלמו במחקרי רצף סביבתי 9,10. שיטות אחרות, כגון מיקוד של endospores בדגימות סביבתיות על ידי נוגדני ניאון 11, כימות של חומצת dipicolinic (DPA) בקרקע 12 ומשקעים 13, cytometry זרימת 14 או פסטור וטיפוח לאחר מכן 15,16 כבר משמשים לאחזור או לכמת endospores ב דגימות סביבתיות. בשנים האחרונות, שיטות מיצוי DNA מותאם כמו גם פריימרים ספציפיים מולקולריים למקד רצפי גני endospore ספציפי פותחו 10,17-20. זה עזר לחשוף יותר מגוון ביולוגי בקרב קבוצה זו של חיידקים 21 וגם הוביל ליישומים בתעשייה וברפואה לצורך זיהוי של endospores, למשל באבקת חלב 19.
הפרוטוקול המובא כאן מבוסס על ההבדל בהתנגדות לתנאי physicochemical מזיקים (כגון חום וחומרי ניקוי) של endospores חיידקים ביחס לתאים של צמח. להשמיד תאים של צמח במדגם, שנתקיים ברצף להחיל חום, יזוזים וריכוזים נמוכים של חומרי ניקוי. הזמן והכוח של טיפולים אלה כבר מותאמים כדי לא להרוס את הנבגים, אבל לlyse כל תאי הצמח. תאים מסוימים בבריכת תא סביבתית הם עמידים יותר מאחרים, ולכן כדי להגדיל את ההסתברות של השמדת כל התאים של הצמח, אנו מיישמים את שלושה טיפולים שונים. היתרון והחידוש של שיטה זו הוא שendospores לאחר הטיפול הוא עדיין שלם ויכול לשמש לניתוח נוסף במורד הזרם. אלה כוללים מיצוי DNA, PCR (qPCR) וamplicon או רצף metagenomic (מיקוד במיוחד הקבוצה של endospores וכך להקטין דiversity, תוך הגדלת כיסוי). Endospores יכול לשמש גם לטיפוח או כימות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי במורד הזרם, cytometry זרימה, או זיהוי של DPA. תכונה חשובה של שיטה זו היא שעל ידי השוואת מדגם שלא טופל עם מדגם מטופלים, אחד יכול להסיק את הכמות ומגוון של endospores במדגם סביבתי בנוסף לרכיב המקביל לשל צמח תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההתנגדות של endospores לגורמים חיצוניים אגרסיביים physicochemical (למשל, טמפרטורה או בדטרגנטים) שימשה כדי להמציא שיטה להפריד endospores חיידקים מהתאים של צמח בדגימות סביבתיות. זוהי השיטה המקיפה הראשונה לבודד endospores מדגימות סביבתיות באופן שאינו הרסני. שיטות קודמות לכמת, לזהות או …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים שוויצרי הקרן הלאומית למדע למענק מס '31003A-132358/1, 31003A_152972 ומס' 151,948, ומרכז המחקר הספרדי פייר מרסייה pour la מדע.
Materials
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich | |
References
- Nicholson, W. L. Roles of Bacillus endospores in the environment. Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).
- Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. Microflora of extreme arid Atacama Desert soils. Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).
- Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America’s Largest Hot Spring. Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).
- Hugenholtz, P. Exploring prokaryotic diversity in the genomic era. Genome Biol. 3 (2), (2002).
- Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes). Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).
- Delmont, T. O., et al. Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).
- Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. . Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications. , (2004).
- Kuske, C. R., et al. Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil. Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).
- von Mering, C., et al. Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments. Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).
- Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes. Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).
- Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis. J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).
- Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence. Int J Microbiol. , 435281 (2011).
- Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid. Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).
- Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus. J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).
- de Rezende, J. R., et al. Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years. ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).
- Hubert, C., et al. Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature. Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).
- Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE. Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).
- Brill, J. A., Wiegel, J. Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method. J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).
- Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder. Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).
- Bueche, M., et al. Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A. Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).
- Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments. Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).
- Nicholson, W. L., Law, J. F. Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168. J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).
