Murin Dermal Fibroblast Isolering av FACS
Summary
Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.
Abstract
Fibroblaster är principen celltyp ansvariga för att utsöndra extracellulära matrisen och är en kritisk komponent i många organ och vävnader. Fibroblast fysiologi och patologi bakom ett spektrum av kliniska enheter, inklusive fibroser i flera organ, hypertrofisk ärrbildning efter brännskador, förlust av hjärtfunktionen efter ischemi, och bildandet av cancer stroma. Men fibroblaster fortfarande en dåligt karakteriserad typ av cell, till stor del på grund av deras inneboende heterogenitet. Befintliga metoder för isolering av fibroblaster kräver tid i cellkultur som i grunden påverkar cellfenotyp och beteende. Följaktligen många studier som undersöker fibroblast biologi åberopa in vitro manipulering och inte korrekt fångar fibroblast beteende in vivo. För att övervinna detta problem har vi utvecklat en FACS-baserat protokoll för isolering av fibroblaster från den dorsala huden hos vuxna möss som inte kräver cellkultur, vari preserving den fysiologiska transkriptions- och proteomik profilen för varje cell. Vår strategi tillåter uteslutning av icke-mesenkymala härstamningar via en härstamning negativ grind (Lin -) snarare än en positiv selektion strategi för att undvika urvals eller anrikning av en subpopulation av fibroblaster som uttrycker specifika ytmarkörer och vara så inkluderande som möjligt över denna heterogena celltyp.
Introduction
Fibroblaster ofta definieras morfologiskt som spindelformade celler som följer plastsubstrat. Fibroblaster är principen celltyp ansvarig för syntetisering och remodeling den extracellulära matrisen i embryonala och vuxna organ 1. Fibroblaster är således kritisk för utveckling däggdjurs- och bidrar väsentligt till den extracellulära miljön som påverkar beteendet hos angränsande celltyper som förekommer i varje vävnad och organ.
Fibroblaster är också den huvudsakliga celltyp bakom en mångfald av medicinska tillstånd som orsakar enorma klinisk börda. Patologisk fibroblast aktivitet försämrar normal vävnadsfunktion och inkluderar vävnads- och organfibros (såsom lunga och lever), ärrbildning efter kutan sårläkning, ateroskleros, systemisk skleros, och bildning av ateromatösa plack efter blodkärlsskada 2-5. Sårläkning i synnerhet, både akut och kroniskt innebär deposition av ärrvävnad som varken Liknar eller fungerar som den normala vävnaden som omger den, och leder till hög sjuklighet över olika patologiska tillstånd. Efter skada, finns det en övergång av fibroblaster till myofibroblaster, som sedan utsöndrar strukturella ECM-komponenter, utöva parakrina effekter på granncelltyper, och återställa mekanisk stabilitet genom att deponera ärrvävnad 6.
I kutana vävnader finns det betydande variationer i kvaliteten på sårläkning över utvecklings tid och mellan anatomiska platser. I de två första trimestern av livet fostret läker utan ärrbildning; Men från den tredje trimestern på och under hela vuxenlivet, människor läka med ett ärr. Platsspecifik, förutom åldersspecifika, existerar skillnader i sårläkning. Sår i munhålan renovera med minimal ärrbildning 7,8, medan ärrvävnad avsättning inom kutana sår är betydande 9. Kontroverser kvarstår concerning den relativa påverkan av miljön kontra inneboende egenskaper lokala fibroblaster om resultatet av sårläkning när det gäller både ålder och plats 10,11. Med tanke på de betydande skillnader i läkning av musen oral kontra kutana dermis och tidigare embryonala (E15) vs. senare embryonala (E18) dermis, är det troligt att inneboende skillnader i befolkningen i fibroblaster vid vissa utvecklingstiden och mellan olika anatomiska platser finns .
År 1986, belägen Harold F. Dvorak tumörer är sår som inte läker 12. Dvorak slutsatsen att tumörer beter sig som sår i kroppen och inducera deras stroma genom att aktivera sårläkningssvaret hos värden. Ett flertal studier har sedan undersökt bidraget av fibroblaster till progressionen av karcinom 13-15, men som i fallet med sårläkning, identiteten och embryonala ursprung fibroblaster som bidrar till den stromala utrymmet i kutan carcinomas har inte varit tillräckligt definierade. Svaret på denna fråga har medicinsk betydelse med tanke på nya studier utsätta tumörassocierade fibroblast som en potentiellt effektiv måltavla för cancerbehandling 16.
Identifiera och prospektivt isolera fibroblast linjerna utrustade med fibrinogen potential in vivo är ett viktigt steg mot ett effektivt sätt manipulera sitt svar på skada inom ett brett spektrum av akuta och kroniska sjukdomstillstånd. År 1987 Cormack visade två subpopulationer av fibroblaster, en bosatt inom papillär och en inom de retikulära dermis 17,18. En tredje subpopulation påträffades i samband med hårsäckarna i dermalpapillen regionen follikeln 19,20. När de odlas dessa fibroblast subtyper uppvisar skillnader i tillväxtpotential, morfologi och tillväxtfaktor / cytokiner profiler 21-24.
Hittills studier som undersöker fibroblast hanterogeneity har till stor del misslyckats med att ge en god beskrivning utvecklings och funktionell mångfald bland fibroblaster in vivo. Detta är delvis en följd av ett beroende av odlade fibroblastceller populationer och homogeniserande effekten av cellkultur eller positiv selektion på basis av en själv ytreceptor inte uttrycks av alla fibroblaster 25. En färsk studie från vårt laboratorium visade en djup ytmarkör och transkriptions förskjutning i odlade vs. obildade fibroblaster isolerade genom FACS-baserade isolering metod som presenteras i detta manuskript 26.
Därefter identifierade vi en särskild fibroblast härstamning inom de murina rygg dermis och fastställt att denna härstamning, som definieras av embryonala uttryck av engrailed-1, är i första hand ansvarig för bindvävs nedfall i rygghuden. Härstamning fungerar under både akuta och kroniska former av fibros, inklusive sårläkning, cancer stroma bildning, ochstrålningsinducerad fibros 27. Karakteriseringen distinkta fibroblaster linjer har kritiska konsekvenser för behandlingar som syftar till att modulera fibrinogen beteende.
Istället för att använda befintliga protokoll som förlitar sig på in vitro manipulation för att uppnå cellisolering 28,29, kommer skörden protokollet (Figur 1) beskrivs här hjälpa avkastning informativa analyser av fibroblaster som mer exakt fånga fenotyp och beteende in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs i detta manuskript erbjuder ett sätt att isolera fibroblaster genom FACS-baserad sortering, i jämförelse med befintliga metoder, som antingen välja en underpopulation eller kräver tid i cellodling före efterföljande analyser. Den tid som krävs från avverkning av huden för sortering av fibroblaster är ungefär 6 h; kommer emellertid antalet möss som användes i skörde påverka denna uppskattning.
Flera punkter i protokollet kräver särskild omsorg. Det f…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av anslag från NIH bidrag R01 GM087609 (till HPL), en gåva från Ingrid Lai och Bill Shu för att hedra Anthony Shu (till HPL), NIH bidrag U01 HL099776 (till MTL), den Hagey Laboratoriet för Pediatric regenerativ medicin och The Oak Foundation (till MTL, GCG och HPL). GGW stöddes av Stanford School of Medicine, Stanford Medical Scientist Training Program, och NIGMS utbildningsbidrag GM07365. Znm stöddes av plastikkirurgi Foundation Research Fellowship Grant och Hagey Family Fund. MSH stöddes av California Institute för regenerativ medicin (CIRM) Clinical Fellow utbildningsbidrag TG2-01159, American Society of Maxillofacial Surgeons (Asms) / käkkirurger Foundation (MSF) Research Grant Award, och Transplant och Tissue Engineering Fellowship Award.
Materials
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastase | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| 40 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| propidium iodide (PI viability stain) | BioLegend | 421301 |
References
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-210 (2008).
- Powell, D. W., et al. Myofibroblasts. I. Paracrine cells important in health and disease. The American journal of physiology. 277, C1-C9 (1999).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal immunology. 2, 103-121 (2009).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: one function, multiple origins. The American journal of pathology. 170, 1807-1816 (2007).
- Li, B., Wang, J. H. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing: force generation and measurement. J Tissue Viability. 20, 108-120 (2011).
- Wong, J. W., et al. Wound healing in oral mucosa results in reduced scar formation as compared with skin: evidence from the red Duroc pig model and humans. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 17, 717-729 (2009).
- Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of dental research. 82, 621-626 (2003).
- Hantash, B. M., Zhao, L., Knowles, J. A., Lorenz, H. P. Adult and fetal wound healing. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 13, 51-61 (2008).
- Buchanan, E. P., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Fetal skin wound healing. Advances in clinical chemistry. 48, 137-161 (2009).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing. The New England journal of medicine. 315, 1650-1659 (1986).
- Dumont, N., et al. Breast fibroblasts modulate early dissemination, tumorigenesis, and metastasis through alteration of extracellular matrix characteristics. Neoplasia. 15, 249-262 (2013).
- Servais, C., Erez, N. From sentinel cells to inflammatory culprits: cancer-associated fibroblasts in tumour-related inflammation. The Journal of pathology. 229, 198-207 (2013).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell cycle. 5, 1597-1601 (2006).
- Li, X., et al. Targeting the cancer-stroma interaction: a potential approach for pancreatic cancer treatment. Current pharmaceutical design. 18, 2404-2415 (2012).
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of cell science. 117, 667-675 (2004).
- Cormack, D. H. . Ham’s Histology. , 450-474 (1987).
- Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Dermal-epidermal interactions. Adult follicle-derived cell populations and hair growth. Dermatologic clinics. 14, 573-583 (1996).
- Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing. Lancet. 358, 1445-1448 (2001).
- Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Construction of a bilayered dermal equivalent containing human papillary and reticular dermal fibroblasts: use of fluorescent vital dyes. Tissue engineering. 2, 39-49 (1996).
- Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204, 526-527 (1979).
- Schafer, I. A., Pandy, M., Ferguson, R., Davis, B. R. Comparative observation of fibroblasts derived from the papillary and reticular dermis of infants and adults: growth kinetics, packing density at confluence and surface morphology. Mechanisms of ageing and development. 31, 275-293 (1985).
- Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Site-matched papillary and reticular human dermal fibroblasts differ in their release of specific growth factors/cytokines and in their interaction with keratinocytes. Journal of cellular physiology. 200, 134-145 (2004).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , e4425 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift in vitro. Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).
- Rinkevich, Y., Walmsley, G. G., Hu, M. S., Maan, Z. N., Newman, A. M., Drukker, M., Januszyk, M., Krampitz, G. W., Gurtner, G. C., Lorenz, H. P., Weissman, I. L., Longaker, M. T. Identification and Isolation of a Dermal Lineage with Intrinsic Fibrogenic Potential. Science. , (2015).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. , (2010).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature protocols. 3, 799-810 (2008).
- Klein, M., Fitzgerald, L. R. Enzymatic separation of intact epidermal sheets from mouse skin. The Journal of investigative dermatology. 39, 111-114 (1962).
- Biburger, M., Trenkwald, I., Nimmerjahn, F. yThree blocks are not enough – Blocking of the murine IgG receptor FcgammaRIV is crucial for proper characterization of cells by FACS analysis. European journal of immunology. , (2015).
