Murino Dermal fibroblasti Isolation di FACS
Summary
Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.
Abstract
I fibroblasti sono il tipo cellulare principio responsabili della secrezione della matrice extracellulare e sono una componente critica di molti organi e tessuti. Fibroblasti fisiologia e patologia alla base uno spettro di entità cliniche, inclusi fibrosi in organi multipli, cicatrici ipertrofiche seguenti ustioni, perdita della funzione cardiaca dopo ischemia, e la formazione di stroma cancro. Tuttavia, i fibroblasti rimangono un tipo di cellula poco caratterizzato, in gran parte a causa della loro eterogeneità. Metodi esistenti per l'isolamento dei fibroblasti richiedono tempo in coltura cellulare che influenza profondamente il fenotipo e il comportamento delle cellule. Di conseguenza, molti studi che hanno valutato fibroblasti biologia basano su manipolazioni in vitro e non colgono accuratamente il comportamento dei fibroblasti in vivo. Per superare questo problema, è stato sviluppato un protocollo basato FACS-per l'isolamento dei fibroblasti dalla pelle dorsale di topi adulti che non richiede di coltura cellulare, così preserving trascrizionale fisiologico e il profilo proteomico di ogni cellula. La nostra strategia consente di esclusione di lignaggi non mesenchimali attraverso un cancello negativo lignaggio (Lin -) piuttosto che una strategia di selezione positiva di evitare la preselezione o l'arricchimento di una sottopopolazione di fibroblasti che esprimono marcatori di superficie specifici ed essere il più inclusivo possibile attraverso questo eterogeneo tipo di cellula.
Introduction
I fibroblasti sono spesso definiti morfologicamente come cellule fusiformi che aderiscono a substrati plastici. I fibroblasti sono il tipo cellulare principio responsabile per la sintesi e il rimodellamento della matrice extracellulare in embrionali e adulte organi 1. I fibroblasti sono quindi fondamentali per lo sviluppo dei mammiferi e contribuiscono in maniera sostanziale l'ambiente extracellulare che influenza il comportamento della vicina tipi presenti in ogni tessuto e organo cellulari.
I fibroblasti sono anche il tipo di cellula principale dietro un insieme eterogeneo di condizioni mediche che causano enorme peso clinico. Attività dei fibroblasti patologica ostacola la funzione tessuto normale e comprende tessuti e fibrosi organi (come il polmone e fegato), cicatrici dopo la guarigione della ferita cutanea, arteriosclerosi, sclerosi sistemica, e la formazione di placche ateromatose dopo la lesione dei vasi sanguigni 2-5. La guarigione delle ferite, in particolare, sia acuta e cronica, coinvolge deposition di tessuto cicatriziale che né assomiglia né funzioni come il tessuto normale circostante, e porta ad una significativa morbilità attraverso diversi stati patologici. Dopo lesioni, vi è una transizione di fibroblasti di miofibroblasti, che poi secernono componenti ECM strutturali, esercitano effetti paracrini sulla vicina tipi cellulari, e ripristinare la stabilità meccanica depositando tessuto cicatriziale 6.
Nei tessuti cutanei esiste significativa variazione della qualità di riparazione della ferita nel tempo di sviluppo e tra siti anatomici. Nei primi due trimestri di vita del feto guarisce senza lasciare cicatrici; tuttavia, dal terzo trimestre su e tutta l'età adulta, gli esseri umani a guarire con una cicatrice. , Oltre a specifiche età, esistono differenze nella guarigione delle ferite site-specific. Le ferite del cavo orale rimodellare con una minima formazione di cicatrici 7,8, mentre la deposizione di tessuto cicatriziale all'interno ferite cutanee è significativo 9. Polemica persiste concerning l'influenza relativa dell'ambiente contro le proprietà intrinseche dei fibroblasti locali sul risultato della guarigione delle ferite per quanto riguarda sia l'età e la posizione 10,11. Date le differenze significative nella guarigione del mouse orale contro derma cutanee e embrionale prima (E15) vs. dopo embrionale (E18) derma, è probabile che esistono differenze intrinseche nelle popolazioni di fibroblasti a una certa età e di sviluppo tra i vari siti anatomici .
Nel 1986, Harold F. Dvorak postulato tumori sono ferite che non guariscono 12. Dvorak concluso che i tumori si comportano come ferite nel corpo e inducono loro stroma attivando la cicatrizzazione risposta dell'ospite. Numerosi studi hanno indagato poiché il contributo dei fibroblasti alla progressione dei carcinomi 13-15, ma come nel caso di guarigione delle ferite, l'identità e l'origine embrionale dei fibroblasti che contribuiscono al compartimento stromale ca cutanearcinomas non è stato adeguatamente definito. La risposta a questa domanda porta rilevanza medica dato recenti studi che denunciano la fibroblasti associati al tumore come un obiettivo potenzialmente efficace per la terapia anti-cancro 16.
Identificare e prospetticamente isolare i lignaggi di fibroblasti dotati di potenziale fibrogenica in vivo è un passo essenziale verso manipolare efficacemente la loro risposta al danno in una vasta gamma di patologie acute e croniche. Nel 1987, Cormack ha dimostrato due sottopopolazioni di fibroblasti, uno residente nel papillare e uno all'interno del derma reticolare 17,18. Una terza sottopopolazione è stata trovata associata a follicoli piliferi nella regione papilla dermica del 19,20 follicolo. Quando coltivate, queste differenze sottotipi di fibroblasti mostrano in un potenziale di crescita, morfologia, e fattore di crescita / citochine Profili 21-24.
Ad oggi, gli studi esaminando fibroblasti luiterogeneity hanno ampiamente fallito per un'adeguata caratterizzazione diversità evolutiva e funzionale tra fibroblasti in vivo. Questo è, in parte, è il risultato di una dipendenza da popolazioni di fibroblasti in coltura e l'effetto omogeneizzante della coltura cellulare o selezione positiva sulla base di un recettore di superficie sé non espressa da tutti fibroblasti 25. Un recente studio condotto dal nostro laboratorio ha dimostrato un marcatore di superficie profonda e spostamento trascrizionale in coltura contro fibroblasti incolti isolati dalla metodologia isolamento basato FACS-presentato in questo manoscritto 26.
Successivamente, abbiamo identificato uno specifico lignaggio fibroblasti nel derma dorsali murine e determinato che questo lignaggio, definita da espressione embrionale engrailed-1, è il primo responsabile per la deposizione di tessuto connettivo nella pelle dorsale. Le funzioni di derivazione durante entrambe le forme acute e croniche di fibrosi tra cui la guarigione delle ferite, cancro formazione stroma, eradiazione indotta fibrosi 27. La caratterizzazione di linee di fibroblasti distinti ha implicazioni fondamentali per terapie volte a modulare comportamento fibrogenica.
Invece di utilizzare protocolli esistenti che si basano su di manipolazione in vitro per ottenere l'isolamento cellulare 28,29, il protocollo di raccolta (figura 1) qui descritto aiuterà rendimento analisi informative di fibroblasti che catturano più accuratamente fenotipo e il comportamento in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto in questo manoscritto offre un mezzo per isolare i fibroblasti mediante selezione basata FACS, in confronto ai metodi esistenti, che permettono di selezionare una sottopopolazione o richiedono tempo di coltura cellulare prima analisi successive. Il tempo richiesto dalla raccolta della pelle a cernita dei fibroblasti è di circa 6 ore; tuttavia, il numero di topi utilizzati nel raccolto influenzerà questa stima.
Diversi punti del protocollo richiedono particolare atte…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione da NIH concedere R01 GM087609 (a HPL), un regalo da Ingrid Lai e Bill Shu in onore di Anthony Shu (a HPL), NIH concedere U01 HL099776 (a MTL), il Laboratorio Hagey per Pediatrica Medicina rigenerativa e la Fondazione Rovere (a MTL, GCG e HPL). GGW è stato sostenuto dalla Stanford School of Medicine, il Programma di Formazione Stanford Medical Scientist, e borsa di formazione NIGMS GM07365. Znm è stato sostenuto dalla chirurgia plastica Research Foundation Fellowship Grant e il Fondo Famiglia Hagey. MSH è stato sostenuto dal California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Clinical Fellow concessione formazione TG2-01159, l'American Society of maxillofacciale Chirurghi (ASMS) / maxillofacciale Chirurghi Foundation (MSF) Research Grant Award, e il trapianto e Tissue Engineering Fellowship Award.
Materials
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastase | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| 40 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| propidium iodide (PI viability stain) | BioLegend | 421301 |
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